目录
- 要点
- 为何莱姆病研究至关重要
- 莱姆病的致病菌
- 基因组内部：独特特征
- 莱姆病细菌的多种物种
- 细菌如何改变其“外衣”
- 莱姆病的完整疾病谱
- 实验室诊断：全局概览
- 细菌培养：培养技术
- 哪些患者样本可用于培养
- 本研究的局限性
- 这对患者意味着什么
- 常见问题解答
- 来源信息
要点
- 莱姆病由伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）引起，这是一种通过硬蜱属（Ixodes）蜱虫传播的螺旋体，美国约95%的病例集中在12个州。
- 细菌培养是证明活动性感染的有力证据，但需要长达12周的时间，并需要特殊的培养基和熟练的显微镜检查人员。
- 游走性红斑是一种至少5厘米的扩展性皮疹，在具有客观证据的患者中至少80%会出现，并且可以进行临床诊断。
- 高达10%的莱姆关节炎患者即使在抗生素治疗后，关节炎症仍可能持续数月或数年，这种情况在与某些HLA DRB变异型相关时更为常见。
- 不同的伯氏疏螺旋体物种在北美、欧洲和亚洲引起疾病，导致晚期表现（如关节炎或慢性萎缩性肢端皮炎）存在区域差异。
莱姆病研究为何重要
莱姆疏螺旋体病（LB）——莱姆病的医学名称——由Ixodes ricinus复合群的蜱虫传播。这些是相同的硬壳蜱，有时被称为鹿蜱，它们在林区叮咬人类。该疾病于20世纪70年代末在美国首次被描述为一种独立的病症。
自1982年公共卫生追踪开始以来，已有超过200,000例病例报告给美国疾病控制与预防中心（CDC）。在1998年至2001年间，每年大约报告17,000例。2002年，这一数字上升至23,763例，全国发病率为每10万人中8.2例。
病例在地理上高度集中。约95%的病例仅发生在12个州：康涅狄格州、特拉华州、缅因州、马里兰州、马萨诸塞州、明尼苏达州、新罕布什尔州、新泽西州、纽约州、宾夕法尼亚州、罗德岛州和威斯康星州。这一集群位于美国的东北部、中大西洋地区和中西部地区。
莱姆病不仅仅是北美的问题。它广泛分布于欧洲各国，也出现在俄罗斯远东地区和亚洲部分地区。由于该疾病如此普遍且地理分布广泛，对可靠实验室检测的需求巨大。仅在美国，估计每年有超过270万份血清样本用于检测针对B. burgdorferi的抗体。
为了满足这一需求，实验室引入了许多不同的检测方法。有些直接检测细菌本身。另一些则通过全细胞裂解物（破碎的细菌材料）、重组抗原（实验室制造的蛋白质）或多肽抗原（短蛋白片段）寻找免疫系统的抗体。这些测试是酶免疫测定（EIA，一种利用颜色变化来检测反应的测试）。本综述评估了这些测试的开发过程及其性能表现。
莱姆病背后的细菌
致病菌Borrelia burgdorferi是一种螺旋体——一种具有多个内鞭毛（内部鞭状尾巴，使其能够游泳）的螺旋形（开瓶器状）细菌。细胞配置有3到10个松散盘绕，长度测量为10到30微米（µm），宽度为0.2到0.5 µm。
该生物体于1982年从媒介蜱Ixodes dammini中首次分离出来，现更名为Ixodes scapularis。随后从皮肤活检标本、脑脊液（CSF，包围大脑和脊髓的液体）和血液样本中培养成功。这些样本来自美国和欧洲的患者。
培养的B. burgdorferi生物体具有运动能力，放置在新鲜制备的载玻片上时会游泳。可以使用暗视野或相差显微镜观察活体生物——这些技术可以在不染色使薄透明物体可见的情况下观察到它们。在通过银染或荧光显微镜方法染色后，也可以在标准光学显微镜下识别它们。
细菌的结构有几层。其超微结构（精细的内部解剖结构）包括：
- 外层粘液表面层（称为S层）
- 围绕周质空间（内膜和外膜之间的间隙）的三层外膜
- 7到11个周质鞭毛位于该空间内
- 最内部的隔室称为原生质圆柱体
基因组内部：不寻常的特征
B. burgdorferi是第一种拥有完整基因组（其全部遗传指令）测序的螺旋体。参考菌株B. burgdorferi sensu stricto B31的基因组总计1,521,419个碱基对（bp）——即遗传代码的单个“字母”。
该总数由一条910,725 bp的线性染色体组成，其G+C含量（衡量DNA化学组成的指标）为28.6%，此外还有21个质粒——9个环状和12个线性——总大小为610,694 bp。质粒是位于主染色体之外的小型独立DNA环或链。
将该基因组与相关的欧洲物种Borrelia garinii菌株PBi的基因组进行比较，研究人员发现大部分染色体是保守的：DNA和氨基酸序列的同源性均为92.7%。染色体加上两个线性质粒（lp54和cp26），携带约860个基因，似乎构成了所有莱姆病Borrelia物种的基本遗传库。并非每个B. burgdorferi菌株都拥有完整的质粒组，因此不同分离株的基因组大小存在差异。
基因组分析揭示了几种在细菌中不常见的特征：
- 线性染色体以及多个线性和环状质粒
- 核糖体RNA基因的独特排列：单个16S rRNA基因（rrs）与串联重复的23S（rrl）和5S（rrf）rRNA基因
- 超过150个脂蛋白编码基因，占染色体基因的4.9%和质粒基因的14.5%——显著高于当时测序的任何其他细菌基因组
- 大量似乎处于进化衰退状态的质粒DNA
- 质粒基因中存在大量潜在近期DNA重排的证据
- 缺乏编码氨基酸、脂肪酸、酶辅因子和核苷酸的已知基因
该细菌还缺乏三羧酸循环酶（细胞能量产生机制的一部分）以及参与电子传递的化合物的基因。综合来看，这些缺失的基因表明B. burgdorferi本质上是寄生的——它依赖宿主提供许多基本构建模块，而不是自行制造。
莱姆病细菌的众多物种
在B. burgdorferi sensu lato复合群（更广泛的莱姆病细菌相关群体）中，已在全球描述了十一种Borrelia物种。它们的分布并不均匀。
- 北美：三种物种——狭义伯氏疏螺旋体、Borrelia andersonii 和 Borrelia bissettii
- 欧洲：五种物种——狭义伯氏疏螺旋体、B. garinii、埃氏疏螺旋体、Borrelia valaisiana 和 Borrelia lusitaniae
- 亚洲（中国、日本、韩国）：七种物种——B. garinii、埃氏疏螺旋体、B. valaisiana、Borrelia japonica、Borrelia tanukii、Borrelia turdi 和 Borrelia sinica
并非所有这些物种都会使人患病。在欧洲，已知至少三种对人类具有致病性（引起疾病）：B. burgdorferi sensu stricto、B. garinii和B. afzelii。在美国，B. burgdorferi sensu stricto是唯一已知引起人类感染的物种。
在B. burgdorferi sensu stricto内部，研究人员已鉴定出几种亚型。研究将特定亚型与患者以及实验感染动物中的血液传播（细菌通过血液循环扩散）和组织侵袭联系起来。
在亚洲，只有B. garinii和B. afzelii被确认为人类病原体。对患者和实验室动物的研究表明，B. bissettii、B. valaisiana和B. lusitaniae也可能具有致病能力，但其感染人类的能力尚未得到充分证实。
遗传比较显示这些物种密切相关，染色体基因顺序高度保守，质粒图谱相似。然而，最近的研究记录了美国和欧洲分离株之间有意义的遗传异质性（变异）。GenBank（由美国国家生物技术信息中心维护的公共数据库）中现已有大量B. burgdorferi sensu lato基因序列，包括fla、vlsE、bmpA和dbpA，以及16S rRNA和外膜蛋白A和C的基因。
细菌如何改变其外衣
B. burgdorferi sensu lato 会根据其所在环境表达不同的表面蛋白——这是一种适应蜱虫和哺乳动物体内不同环境的生存策略。这对诊断至关重要。
当螺旋体存在于未吸血蜱虫的中肠时，它表达 OspA 但不表达 OspC。在蜱虫吸血期间，部分螺旋体停止产生 OspA 并开始转而产生 OspC。其他基因仅在哺乳动物宿主中表达，或在此环境中显著上调。这些基因包括 VlsE、DbpA、BBK32、Erp 和 Mlp 蛋白。
研究人员已使用全基因组微阵列（一种可同时测量数千个基因活性的工具）来研究模拟未吸血蜱虫、吸血蜱虫和哺乳动物宿主条件下的基因表达。在一项关键实验中，B. burgdorferi B31 分别在 23°C 和 35°C 下培养，以模拟蜱虫媒介和哺乳动物宿主中的温度。共有 215 个开放阅读框（基因序列）在这两个温度下差异表达。引人注目的是，其中 136 个——占 63%——位于质粒上。这一发现突显了质粒携带的基因在适应不同环境中的重要性。
遗传多样性和差异基因表达对实验室检测有直接影响。PCR 引物（用于检测细菌遗传物质的短 DNA 序列）的选择可针对基因组的不同片段。抗体测试中特定抗原的选择也会改变诊断检测的敏感性和特异性。
莱姆病的全谱系表现
B. burgdorferi sensu lato 感染可导致皮肤、神经、心脏和肌肉骨骼疾病。其基本临床表现全球相似，但欧洲与北美之间存在有据可查的差异。这些差异归因于各大洲引起疾病的细菌物种不同；即使在欧洲内部，由于优势物种的不同，模式也因地而异。
早期感染通常以局部游走性红斑（EM）开始——这种不断扩大的红色皮疹常被称为“牛眼”疹。几天或几周内，可能会出现累及皮肤、神经系统、心脏或关节的播散性感染的临床证据。数月后，可能出现晚期感染。
EM 是早期感染的特征性体征，也是莱姆病的临床标志。在最近的病例系列中，在有客观临床证据表明符合美国疾病控制与预防中心（CDC）监测定义的感染者中，至少 80% 的患者被识别出有此皮疹。皮疹始于蜱虫叮咬部位，表现为红色斑疹或丘疹（平坦或轻微隆起的斑点），迅速扩大，有时出现中央消退。
伴有 EM 的早期莱姆病的临床诊断依赖于识别直径至少为 5 厘米的皮肤损害的特征外观。在此阶段，患者可能没有任何症状。在美国更常见的情况是，患者可能出现流感样症状，如头痛、肌痛（肌肉酸痛）、关节痛或发热。
一些研究者将全身症状与 EM 的组合视为播散的证据，但作者指出这并非基于证据。他们更倾向于将此表现称为“有症状的 EM”。
血行播散（通过血液传播）可累及神经系统、关节、心脏或其他皮肤区域。偶尔，血行播散会到达其他器官，并产生广泛的早期莱姆病表现。具有客观播散证据的患者通常会出现以下一种或多种综合征：
- 多发性 EM 皮损
- 房室传导阻滞（心脏电信号传导中断）
- 心肌心包炎（心肌及其周围心包的炎症）
- 关节炎
- 面瘫（面神经无力）
- 脑膜炎（脑和脊髓周围膜的炎症）
- 脊神经根炎，又称班纳沃特综合征（Bannwarth's syndrome）（神经根炎症）
部分未经治疗的患者在蜱传感染后数月到数年内可能发展为晚期莱姆病。其主要表现为关节炎、晚期神经莱姆病（周围神经病变或脑脊髓炎——神经损伤或脑和脊髓炎症）以及慢性萎缩性肢端皮炎（ACA，一种缓慢进展的皮肤状况）。
莱姆关节炎始于间歇性的单关节或少关节关节炎（累及一个或少数几个关节），尤其是大关节。在高达 10% 的患者中，尽管接受了抗微生物药物（抗生素及相关药物）治疗，关节炎仍可能持续数月或数年。具有特定 HLA DRB 等位基因（遗传性免疫系统基因变异）的患者中更常见治疗抵抗性关节炎。研究人员认为，自身免疫——即免疫系统攻击自身组织——在此类病例中发挥作用。
患者的居住地会影响晚期疾病的表现形式。莱姆关节炎是北美最常见的晚期表现，而慢性萎缩性肢端皮炎似乎是欧洲最常见的晚期表现。同样，这些差异可能归因于不同大陆上引起感染的细菌种类不同。
实验室诊断：全局概览
已开发出多种实验室技术来直接检测 B. burgdorferi 复合群。这些测定提供了蜱媒介、储存宿主（在自然界中携带细菌的动物）或患者体内完整螺旋体或螺旋体成分（如DNA或蛋白质）存在的证据。
临床实验室采用了四种不同的方法：
- 基于显微镜的测定
- 检测 B. burgdorferi 特异性蛋白质
- 检测 B. burgdorferi 特异性核酸（DNA）
- 培养（分离培养该生物体）
其中，B. burgdorferi 复合群的培养无疑提供了对活动性感染最有力的确认，并且越来越多地被跨大西洋两侧的研究人员用作诊断工具。培养该生物体还使科学家能够研究不同物种的结构、分子、抗原性和致病特性。
由于临床样本中的细菌数量极其稀少，直接显微镜检测细菌在确认莱姆病方面的临床效用有限。除PCR以外的抗原检测测定也面临同样的问题。抗原捕获试验已用于检测神经莱姆病患者脑脊液中的细菌抗原。这些测试也已用于疑似莱姆病患者的尿液样本中，但其可靠性较差，或者充其量值得怀疑。
细菌培养：培养技术
如今用于培养 B. burgdorferi 复合群的液体培养基（营养液）是通过随着时间的推移对原始的Kelly培养基进行一系列改良而衍生出来的。当前版本包括：
- Barbour-Stoenner-Kelly II培养基 (BSK II) — 使用不含谷氨酰胺的CMRL-1066，以及Yeastolate、作为肽类制备物的neopeptone，并以HEPES作为缓冲剂
- BSK-H — 省略明胶并使用不同比例的一些成分
- Kelly培养基 Preac-Mursic (MKP) — 去除Yeastolate并使用不同比例的一些成分；也称为Pettenkofer改良版
- Stoerner改良版 — 添加Yeastolate和CMRL-1066，不含谷氨酰胺且不含碳酸氢钠
这些现代培养基比旧版本支持更好的生长。它们允许从低接种量（少量起始细菌数）中恢复，产生更短的代时，并达到约 每毫升 108 到 109 个生物体 的最大螺旋体浓度。
BSK II的关键成分包括CMRL-1066，这是一种用于培养哺乳动物细胞的标准化培养基。其他成分包括牛血清白蛋白第五组分（一种丰富的蛋白质来源，同时也稳定pH值）和N-乙酰葡糖胺（细菌细胞壁的构建模块）。BSK II还包括兔血清、柠檬酸盐、丙酮酸和许多其他成分。这些培养基促进生长的能力取决于对关键成分的仔细选择，而这些成分在组成上可能差异很大。
培养条件也很重要。39°C（约102°F）或更高的温度可能会减少或阻止生长。培养物需孵育 长达12周 — 这比大多数其他人类细菌病原体所需的时间长得多。这段漫长的等待反映了螺旋体在对数生长期具有 7到20小时或更长的代时。
实验室通过定期检查培养液样本中的螺旋体来检测其生长。实验室使用暗视野显微镜或荧光显微镜，并在用吖啶橙染料或特异性荧光标记抗体染色后观察。任何看到的螺旋体样结构必须确认为B. burgdorferi sensu lato，方法是通过显示与特异性单克隆抗体（相同的、实验室制造的免疫蛋白）的反应性，或使用PCR检测特定的DNA序列。
经验在此至关重要。由于缺乏对B. burgdorferi sensu lato显微镜检测的熟悉程度，可能会导致假阳性结果，因为其他结构（如细胞碎片）可能呈丝状，从而被误认为是细菌。
该生物体也可在固体培养基上培养，通过添加琼脂糖使液体培养基凝固，并在微需氧（低氧）或厌氧（无氧）条件下进行孵育。固体培养基的一个优势是可以识别单个菌落，使研究人员能够分离特定的克隆菌株。
B. burgdorferi sensu lato 的实验室培养菌株也可与蜱细胞系和某些哺乳动物细胞系共同培养（一起生长）。这些共培养技术可能有助于直接从临床标本中分离该细菌。
哪些患者样本可以进行培养
B. burgdorferi sensu lato 可从莱姆病患者的一系列组织和体液中分离出来。包括：
- 来自游走性红斑（EM）皮肤病变的活检和灌洗（冲洗）标本
- 来自慢性萎缩性肢端皮炎（ACA）皮肤病变的活检标本
- 来自伯氏疏螺旋体淋巴细胞瘤皮肤病变的活检标本（一种与莱姆病相关的罕见良性皮肤结节）
- 脑脊液
- 血液
这种广泛的样本类型非常重要，因为生物体的分离在很大程度上取决于所采样的组织以及疾病所处的阶段。原始科学评论从此处继续深入讨论分子检测方法。这些方法包括PCR和实时定量PCR。该评论还涵盖了免疫学诊断。它还包括抗体检测方法，如免疫荧光测定。该评论还讨论了酶免疫测定、Western免疫印迹法、双阶检测以及使用重组和肽抗原的新测试。它还进一步涵盖了伯氏疏螺旋体杀菌抗体测定、循环免疫复合物结合抗体的检测、脑脊液中的抗体检测以及细胞免疫反应测试。
本研究的局限性
本评论描述了截至2005年的诊断测试状况，因此所讨论的技术和引用的性能数据反映了当时可用的技术。此后已有新方法进入实验室。
整个领域存在若干局限性。直接显微镜检测受限于患者样本中生物体数量极少的事实。PCR以外的抗原检测测试结果可靠性差或存疑。虽然培养是确认活动性感染的最强证据，但需要长达12周的时间，需要特殊的培养基和熟练的显微镜检查人员，且当工作人员缺乏经验时可能会产生假阳性结果。即使是细菌基因组也在菌株之间存在差异。基因表达会根据生物体是在蜱体内还是哺乳动物体内而发生变化——这些因素可以改变特定诊断测试的性能。
该评论还指出了一些知识尚未确定的领域。B. bissettii、B. valaisiana 和 B. lusitaniae 引起人类疾病的能力尚未得到充分证实。作者将伴随游走性红斑出现的全身症状证明感染已扩散的观点描述为缺乏证据支持。
这对患者意味着什么
您可能居住在美国东北部、中大西洋地区或中北部地区。您可能曾前往这些地区旅行。您可能也居住在莱姆病发生的欧洲或亚洲部分地区，或曾前往这些地方旅行。了解诊断情况会有所帮助。了解诊断情况可以帮助您与医生进行更好的沟通。
- 了解皮疹。 至少有80%的有客观证据表明患有莱姆病的患者会出现游走性红斑。持续数天扩大的至少5厘米大小的皮肤病变是典型体征，可以通过临床诊断，无需实验室检测。
- 预期首先进行临床诊断。 当出现特征性皮疹时，医生通常仅凭外观即可诊断早期莱姆病。
- 了解培养需要时间。 培养细菌是确认活动性感染的最强证据，但由于生物体分裂缓慢——大约每7到20小时分裂一次——培养物需保留长达12周。
- 询问正在检测哪种样本。 该细菌在不同阶段存在于身体的不同部位——包括游走性红斑（EM）、慢性萎缩性肢端皮炎或伯氏疏螺旋体淋巴细胞瘤病变的皮肤活检、脑脊液和血液。选择合适的样本取决于您的症状。
- 询问检测的局限性。 显微镜检查和非PCR抗原检测可能会漏检病原体或产生不可靠的结果，而培养结果的判读需要经验以避免假阳性。
- 报告持续的关节症状。 高达10%的莱姆关节炎患者即使在抗生素治疗后，关节炎症仍可能持续数月甚至数年。这种情况在有特定遗传HLA DRB基因变异的人群中更为常见。
综上所述：莱姆病很常见，具有地理聚集性，由一种遗传复杂的病原体引起，该病原体在蜱和人类之间传播时会改变其表面蛋白。正是这种复杂性导致没有任何单一实验室检测是完美的，因此诊断仍取决于结合您的症状、暴露史以及精心选择的实验室结果。
常见问题解答
确认活动性莱姆感染最可靠的方法是什么？
在培养中分离出该细菌是证明活动性感染的有力证据。然而，这种方法耗时且技术要求高，因为病原体大约每7到20小时分裂一次，因此可能需要长达12周的时间。它还需要特殊的培养基和熟练的显微镜检查人员以避免假阳性读数。
莱姆病培养需要多长时间，为什么？
培养物会保留长达12周。等待时间较长是因为该细菌在对数生长期具有7到20小时或更长的代时。实验室会使用暗视野显微镜或荧光显微镜定期检查是否有生长迹象，任何螺旋体样结构都必须通过特异性抗体或DNA检测进行确认。
哪些身体样本可以检测莱姆病细菌？
可以从多种组织和体液中获得该细菌：包括游走性红斑、慢性萎缩性肢端皮炎或伯氏疏螺旋体淋巴细胞瘤病变的皮肤活检、脑脊液和血液。选择合适的样本取决于您的症状和疾病阶段，因为病原体在不同时间存在于身体的不同部位。
没有实验室检测能诊断莱姆病吗？
可以。当出现典型的游走性红斑皮疹时，医生通常仅凭其外观即可诊断早期莱姆病。这种皮疹出现在至少80%有客观感染证据的患者中，且持续数天扩大的至少5厘米大小的皮肤病变是典型体征。
如果我的莱姆关节炎对抗生素治疗没有改善，这意味着什么？
高达10%的莱姆关节炎患者即使在抗生素治疗后，关节炎症仍可能持续数月甚至数年。这种耐药形式在有特定遗传HLA DRB基因变异的人群中更为常见，研究人员认为自身免疫性在这一类关节炎中起作用。
为什么北美和欧洲的莱姆病症状有所不同？
不同伯氏疏螺旋体物种导致每个大陆上的感染。在北美，仅发现B. burgdorferi sensu stricto一种物种可引起人类感染，且莱姆关节炎是最常见的晚期表现。在欧洲，有三种物种具有致病性，慢性萎缩性肢端皮炎是最常见的晚期表现。
抗原检测或显微镜检查对诊断莱姆病可靠吗？
直接显微镜检测的临床效用有限，因为临床样本中的病原体数量稀少。除PCR外的抗原检测也存在同样的问题。用于脑脊液或尿液的抗原捕获检测可靠性差或存疑。培养仍是确认活动性感染的最有力证据，尽管它耗时且技术要求高。
我有莱姆病血清学阴性结果，但关节和心脏症状持续存在——我应该在什么时候寻求关于莱姆病诊断的第二诊疗意见？
阴性抗体检测结果并不能排除莱姆病，因为检测性能会因细菌种类、所选抗原以及疾病阶段的不同而有所变化。培养该细菌可以确认活动性感染，但需要长达12周的时间，需要特殊的培养基和熟练的显微镜检查人员，仅适用于未经治疗的患者，并且在皮肤以外的疾病（如关节或心脏受累）中敏感性极低。如果您的症状在阴性结果后仍然持续存在，或者关节炎症在抗生素治疗后持续数月，独立的专家复核可以帮助澄清情况。对您暴露史、症状和实验室结果的独立复核有助于澄清病情。Diagnostic Detectives Network 提供独立的专家第二诊疗意见。
来源信息
Original article title: Diagnosis of Lyme Borreliosis
Publication details: Clinical Microbiology Reviews, July 2005, Volume 18, Number 3, pages 484–509. Copyright © 2005, American Society for Microbiology. DOI: 10.1128/CMR.18.3.484–509.2005.
这篇患者友好的文章基于同行评审的研究。
