Raggiungere l'ultra-alta sensibilità nell'analisi degli estrogeni: una guida per una misurazione accurata in popolazioni speciali con bassi livelli ormonali

Indice dei contenuti

• Punti chiave
• Perché la misurazione degli estrogeni è importante
• Come vengono elaborati gli estrogeni nell'organismo
• La sfida speciale: popolazioni con estrogeni molto bassi
• Il metodo gold standard: cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa
• Preparazione del campione: prepararsi per l'analisi
• Derivatizzazione: aumentare la sensibilità attraverso la chimica
• Separazione cromatografica: distinguere molecole simili
• Effetti matrice: il problema nascosto delle interferenze
• Implicazioni cliniche: cosa significa per i pazienti
• Limiti dell'approccio attuale
• Raccomandazioni per ricercatori e clinici
• Domande frequenti
• Informazioni sulla fonte

Punti chiave

• I vecchi immunodosaggi per gli estrogeni spesso fornivano letture imprecise a causa della reattività crociata con molecole simili.
• La moderna diluizione isotopica con isotopi stabili accoppiata alla cromatografia liquida e alla spettrometria di massa è il gold standard per la misurazione degli estrogeni.
• Nelle donne in postmenopausa e negli uomini più anziani, i livelli di estrogeni sono spesso inferiori a 5 pg/mL, richiedendo metodi ultra-sensibili.
• Un metodo che utilizza la derivatizzazione con NMPS richiede solo 0,1 mL di siero e può misurare cinque estrogeni con elevata sensibilità.
• La contaminazione da materiali di laboratorio, come le provette di vetro, può aumentare falsamente i risultati degli estrogeni e deve essere verificata.

Perché la misurazione degli estrogeni è importante

La misurazione degli estrogeni è una pietra miliare dell'endocrinologia moderna. Svolge un ruolo critico nella valutazione clinica di molti disturbi endocrini (ormone-correlati), così come nella ricerca che indaga come gli ormoni influenzano la biologia umana e le malattie. Per quasi 30 anni, scienziati e clinici si sono affidati a dosaggi radioimmunologici (RIA) convenzionali o a dosaggi immunoenzimatici diretti per misurare i livelli circolanti di estrogeni.

Questi metodi più datati offrivano una buona sensibilità, ma presentavano un grave inconveniente: una mancanza di specificità. Gli anticorpi utilizzati negli immunodosaggi spesso mostrano reattività crociata con altri steroidi — molecole chimicamente simili agli estrogeni — portando a letture imprecise. Questa reattività crociata ha causato problemi significativi nell'interpretazione dei dati provenienti da studi epidemiologici, e i risultati sono spesso variati da un laboratorio all'altro.

Un'altra importante limitazione dei metodi basati su immunodosaggi è che possono misurare solo un analita alla volta. Per misurare tutti i metaboliti (prodotti di degradazione) di un singolo estrogeno, i ricercatori devono eseguire molteplici dosaggi separati, il che è dispendioso in termini di tempo e inefficiente. Nell'ultimo decennio, tuttavia, progressi significativi in una tecnica chiamata metodo di diluizione isotopica con isotopi stabili (SID) accoppiata alla cromatografia liquida–spettrometria di massa in modalità di monitoraggio di reazioni selezionate (LC-SRM/MS) hanno offerto una potente soluzione a questi problemi.

Eppure, anche con questa tecnologia avanzata, una sfida rimane scoraggiante: quantificare gli estrogeni e i loro metaboliti in campioni di siero e plasma provenienti da popolazioni con livelli di estrogeni estremamente bassi. Questo include uomini più anziani, bambini, donne in postmenopausa e donne che ricevono inibitori dell'aromatasi per il trattamento del carcinoma mammario. Questa revisione, redatta da ricercatori della Perelman School of Medicine dell'Università della Pennsylvania e dell'Istituto di Medicina delle Radiazioni di Pechino, esamina le questioni speciali coinvolte nell'utilizzo della metodologia SID LC-SRM/MS ad altissima sensibilità per questi campioni difficili, e suggerisce le migliori pratiche in ogni fase del processo analitico.

Come gli estrogeni vengono elaborati nell'organismo

Comprendere come gli estrogeni si comportano nell'organismo aiuta a spiegare perché la loro misurazione è così importante. Molteplici studi clinici e sperimentali hanno dimostrato che livelli relativamente elevati di estrogeni nel sangue delle donne sono associati a un aumentato rischio di carcinoma mammario, carcinoma dell'endometrio e carcinoma ovarico — sebbene, in particolare, molti di questi studi abbiano utilizzato dosaggi RIA di validità discutibile. Negli uomini, l'aumento degli estrogeni circolanti è anche un potenziale fattore di rischio per il carcinoma prostatico.

La capacità di misurare accuratamente l'estradiolo (E2) e il testosterone (T) nei bambini si è dimostrata critica per la diagnosi e il trattamento dei disturbi della pubertà e dello sviluppo sessuale. Alcuni studi hanno anche dimostrato che livelli più elevati di estrogeni in età più precoci sono correlati con l'inizio dello sviluppo mammario nelle ragazze, suggerendo che gli ormoni durante lo sviluppo potrebbero modulare il rischio di malattia più avanti nella vita.

Gli estrogeni agiscono attraverso due vie principali: meccanismi dipendenti dal recettore degli estrogeni (ER) e meccanismi indipendenti dall'ER. La via dipendente dall'ER comporta la stimolazione diretta della proliferazione cellulare anomala, che è causalmente correlata allo sviluppo del carcinoma mammario. Si ritiene che gli effetti cancerogeni (che causano il cancro) indipendenti dall'ER avvengano attraverso le azioni di metaboliti estrogenici genotossici — ovvero che danneggiano il DNA.

Ecco come funziona questo processo:

1. Gli estrogeni progenitori subiscono un metabolismo ossidativo (modificazione chimica da parte di enzimi) attraverso gli enzimi citocromo P450 (CYP) 1B1 e CYP3A4.
2. Questo processo forma due tipi di metaboliti estrogenici catecolici (una struttura chimica con due gruppi ossidrilici adiacenti): 2,3-catecoli (2-OH-E1 e 2-OH-E2) e 3,4-catecoli (4-OH-E1 e 4-OH-E2).
3. Il CYP1B1 mostra una considerevole regioselettività — una preferenza di 9:1 — per la formazione di 4-OH-E1 e 4-OH-E2 rispetto alle forme 2-idrossilate.
4. La ricerca suggerisce che 4-OH-E1 e 4-OH-E2 sono più genotossici (dannosi per il DNA) rispetto ai corrispondenti metaboliti 2-OH-E1 e 2-OH-E2.

È interessante notare che non tutti i metaboliti degli estrogeni sono dannosi. Il 2-OH-E2 è un potente inibitore dell'aromatasi (un enzima che converte gli androgeni in estrogeni), e il 2-OH-E1 è associato a un rischio ridotto di carcinoma mammario positivo per il recettore degli estrogeni (ER+) nelle donne in postmenopausa, dopo aggiustamento per le concentrazioni circolanti di estrone (E1). Entrambi i catecoli vengono rapidamente convertiti da un enzima chiamato catecol-O-metiltransferasi (COMT) in metaboliti metossi (OMe). In particolare, il 2-OMe-E2 ha una significativa attività anti-proliferativa, il che significa che aiuta a prevenire la moltiplicazione incontrollata delle cellule.

Gli estrogeni e i loro metaboliti idrossilati sono anche prontamente modificati dall'aggiunta di gruppi glucuronide, solfato o glutatione (GSH), formando metaboliti estrogenici coniugati. I coniugati estrogenici circolanti più abbondanti sono i solfati, che possono servire come precursori degli estrogeni nel tessuto mammario attraverso l'azione delle solfatasi steroidee. Gli androgeni circolanti possono anche servire come precursori degli estrogeni nelle donne in postmenopausa attraverso l'azione dell'aromatasi — fornendo una fonte fondamentalmente diversa di estrogeni rispetto alle donne in premenopausa.

A causa di questi effetti vari e delle vie metaboliche, gli estrogeni e i loro metaboliti nel flusso sanguigno sono biomarcatori preziosi — indicatori biologici — della biosintesi e del metabolismo degli estrogeni nei tessuti.

La sfida speciale: popolazioni con estrogeni molto bassi

Per la maggior parte degli adulti in età riproduttiva, i livelli di estrogeni sono sufficientemente elevati da poter essere misurati con tecniche standard. Ma alcuni gruppi presentano una sfida analitica formidabile perché i loro livelli di estrogeni sono straordinariamente bassi.

Le concentrazioni sieriche tipiche di E2 non coniugato nelle donne in postmenopausa e negli uomini più anziani sono spesso inferiori a 5 pg/mL (picogrammi per millilitro — un picogrammo è un bilionesimo di grammo). Per confronto, i livelli di E1 non coniugato in questi gruppi variano da 11,8 a 37,4 pg/mL. I livelli di E2 negli studi clinici di endocrinologia pediatrica sono stati segnalati come circa 100 volte inferiori rispetto a quelli degli adulti, con i livelli più bassi che si verificano negli stadi pre-puberali (prima della pubertà).

Questi bassi livelli di pg/mL sono estremamente impegnativi per la maggior parte dei saggi basati su LC-MS. A peggiorare le cose, altri metaboliti estrogenici non coniugati — come i metossi-estrogeni (MeO-estrogeni) o i catecoli — sono presenti a concentrazioni ancora più basse, generalmente al di sotto del limite inferiore di quantificazione (LLOQ, la quantità più piccola che può essere misurata in modo affidabile) della maggior parte dei saggi LC-MS standard.

La sfida della sensibilità deriva principalmente dalle scarse efficienze di ionizzazione degli estrogeni non coniugati e dei loro metaboliti — il che significa che non acquisiscono facilmente la carica elettrica necessaria affinché la spettrometria di massa li rilevi. Questo è il motivo per cui gli scienziati hanno sviluppato numerose strategie di derivatizzazione (modifiche chimiche) per migliorare la ionizzazione e aumentare la sensibilità. Queste strategie spesso aiutano anche con la purificazione del campione.

In realtà è più facile misurare gli estrogeni totali (forme non coniugate più quelle coniugate) dopo idrolisi o solvolisi (decomposizione chimica mediante acqua o alcol), perché i livelli di estrogeni totali sono almeno 2–3 volte più alti rispetto ai livelli di estrogeni non coniugati. Tuttavia, valutare l'efficienza e l'uniformità dell'idrolisi tra i campioni rimane problematico e può produrre risultati errati, perché gli standard autentici e gli standard isotopici stabili non sono sempre disponibili per tutti i coniugati estrogenici.

Il metodo gold standard: cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa

Il metodo di diluizione isotopica con isotopi stabili (SID) combinato con la cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa in modalità di monitoraggio di reazioni selezionate (LC-SRM/MS) è oggi ampiamente accettato come il "gold standard" per la quantificazione degli estrogeni e dei loro metaboliti nel siero e nel plasma. Rispetto agli immunodosaggi, questo approccio offre una specificità migliorata, un'elevata accuratezza e la capacità di monitorare più estrogeni contemporaneamente.

Il principio funziona così: i ricercatori aggiungono una quantità nota di una versione "pesante" (marcata isotopicamente) di ciascun estrogeno al campione del paziente. Poiché le versioni marcate e non marcate si comportano in modo identico durante l'estrazione e l'analisi, i ricercatori possono calcolare la quantità esatta di estrogeno naturale presente confrontando i due segnali. Questo approccio autocorrettivo elimina molti degli errori che affliggono i metodi più vecchi.

È possibile ottenere una sensibilità ultra-elevata quando le molecole di estrogeni vengono convertite in derivati "pre-ionizzati" (forme chimicamente modificate che portano già una carica) e analizzate utilizzando spettrometri di massa a triplo quadrupolo in modalità di monitoraggio di reazioni selezionate (SRM), accoppiati con cromatografia liquida a nanoflusso (una tecnica che utilizza portate estremamente piccole).

Due metodi fondamentali dimostrano la potenza di questo approccio:

• 2011 — Metodo con derivato Girard P (GP): Utilizzato per l'analisi di E1 e dei suoi metaboliti. Ha permesso ai ricercatori di utilizzare solo 0,5 mL di siero. Il LLOQ per ciascun estrogeno era di 0,156 pg/mL (15,6 femtogrammi [fg] in colonna) — un femtogrammo è un milionesimo di miliardesimo di grammo.
• 2015 — Metodo con derivato N-metil piridinio-3-sulfonile (NMPS): Utilizzato per E2 e i suoi metaboliti. Richiedeva solo 0,1 mL di siero — una singola goccia — eppure ha raggiunto una sorprendente sensibilità in colonna di 1,0 fg per cinque estrogeni e i loro metaboliti.

Preparazione del campione: prepararsi per l'analisi

Prima che possa avvenire qualsiasi misurazione degli estrogeni, il campione deve essere preparato. Ciò comporta tipicamente l'estrazione (separazione degli estrogeni dagli altri componenti del sangue), la purificazione e la concentrazione. Esistono due approcci principali per la gestione degli estrogeni coniugati: possono essere scomposti in forme non coniugate mediante idrolisi prima dell'analisi, oppure possono essere misurati come coniugati intatti.

L'idrolisi converte i coniugati in forme non coniugate, il che aumenta la loro concentrazione nel campione. Dopo l'idrolisi, l'estrazione liquido-liquido (LLE) o l'estrazione in fase solida (SPE) possono estrarre in modo efficiente gli estrogeni da siero e plasma.

Estrazione liquido-liquido (LLE): La LLE è economica, veloce e spesso è il metodo di estrazione primario per l'analisi degli estrogeni. I suoi svantaggi includono l'essere laboriosa, dispendiosa in termini di tempo e più difficile da automatizzare rispetto alla SPE. I solventi più comunemente utilizzati sono il metil tert-butil etere (MTBE), l'etere dietilico, il diclorometano o miscele di solventi organici. L'MTBE può estrarre sia gli estrogeni non coniugati dal siero sia i derivati estrogenici dal tampone di derivatizzazione.

Un'indagine approfondita di Keski-Rahkonen e colleghi ha confrontato l'efficienza di estrazione di MTBE, etere dietilico, esano e 2-metilbutano da campioni di siero. Lo studio ha dimostrato che la LLE con MTBE ha recuperato completamente gli ormoni steroidei testati, a differenza degli altri solventi, rendendolo la scelta preferita.

Estrazione in fase solida (SPE): La SPE off-line o on-line accoppiata con LC-MS è una tecnica molto promettente per l'analisi semi-automatizzata dei campioni. I vantaggi della SPE on-line includono tempi di analisi più brevi, bande cromatografiche più concentrate e un rischio di contaminazione notevolmente ridotto.

Uno studio notevole di Zhao e colleghi ha riportato un metodo LC-MS per la determinazione di 12 estrogeni non coniugati e dei loro coniugati intatti nel sangue e nelle urine. Questo metodo utilizzava un solo passaggio SPE sia per gli estrogeni non coniugati sia per i loro coniugati: dopo aver caricato i campioni su una cartuccia Oasis HLB (bilancio idrofilo-lipofilo), gli estrogeni non coniugati venivano prima eluiti con acetato di etile, e i coniugati venivano poi eluiti con metanolo contenente idrossido di ammonio allo 0,1%.

Uno studio più recente ha riportato un processo automatizzato di intrappolamento ed eluizione in linea che utilizza una colonna trappola a materiale ad accesso ristretto (RAM) a scambio cationico debole (WCX) con diluizione in linea. Questo approccio mostra potenziale per l'uso con campioni provenienti da uomini anziani, bambini e donne in postmenopausa, poiché la procedura semplificata richiede solo 100 μL di siero, raggiunge un LLOQ di 3 pg/mL e fornisce eccellenti accuratezza e precisione.

Due approcci per gli estrogeni coniugati:

Il primo approccio prevede l'idrolisi dei coniugati β-glucuronide e solfato prima dell'estrazione e della derivatizzazione. L'enzima più comunemente utilizzato è la β-glucuronidasi/arilsolfatasi purificata dalla lumaca Helix pomatia. Questo enzima contiene naturalmente attività sia β-glucuronidasica che solfatasica in quantità quasi uguali. Al contrario, l'enzima da E. coli contiene solo β-glucuronidasi ed è essenzialmente privo di attività solfatasica.

Tuttavia, i ricercatori dovrebbero essere cauti: le evidenze mostrano che l'estratto di Helix pomatia è contaminato con attività 3β-idrossisteroide deidrogenasi (HSD) o colesterolo ossidasi. Ciò potrebbe confondere gli studi in cui gli analiti di interesse sono substrati della 3β-HSD — una questione molto importante se gli androgeni vengono analizzati nello stesso campione.

Esperimenti con coniugati solfato di estrogeni sintetizzati hanno rivelato un'altra limitazione critica: solo la forma 3-solfato viene scissa dall'idrolisi enzimatica; il gruppo 17-solfato è resistente. Un'alternativa promettente prevede la solvolisi dei coniugati utilizzando acido cloridrico metanolico anidro — un approccio pubblicato per la prima volta da Tang e Crone nel 1989 e successivamente utilizzato da diversi gruppi di ricerca. Sorprendentemente, questo metodo non sembra essere stato applicato a campioni di siero e plasma provenienti da uomini anziani, bambini e donne in postmenopausa.

Il secondo approccio prevede l'analisi del coniugato intatto mediante spettrometria di massa in modalità a ioni negativi, senza idrolisi enzimatica o derivatizzazione. Studi recenti hanno osservato che la concentrazione totale di E1 nelle donne in postmenopausa varia da 61,3 a 442,1 pg/mL, incluso l'E1 solfato a una concentrazione media di 244,8 pg/mL. Questi livelli più elevati di E1 glucuronide o E1 solfato potrebbero essere quantificati relativamente facilmente mediante LC-MS. L'E1 solfato nel siero può essere estratto in modo efficiente utilizzando cartucce Oasis HLB o a scambio anionico debole (WAX) ed eluito con acetato di ammonio o idrossido di ammonio.

Questo approccio del coniugato intatto è promettente ma affronta un ostacolo significativo: la mancanza di standard autentici di coniugati estrogenici e di analoghi isotopici stabili pesanti da utilizzare come standard interni. Ad esempio, solo uno dei cinque possibili E2 solfati (3-solfato, 17-solfato, 3-solfato 17-glucuronide, 3-glucuronide 17-solfato e 3,17-bis-solfato) è attualmente disponibile in commercio: il 17β-E2-2,4,6-[²H]₄-3-solfato.

Derivatizzazione: aumentare la sensibilità attraverso la chimica

Poiché gli estrogeni non coniugati esistono a concentrazioni estremamente basse nel sangue di uomini anziani, bambini e donne in postmenopausa, una misurazione affidabile richiede attualmente la derivatizzazione — l'attacco di un gruppo chimico alla molecola di estrogeno per migliorarne la capacità di essere rilevata. Molti reagenti di derivatizzazione chimica sono stati sviluppati a questo scopo, mirando al gruppo ossidrilico fenolico (un gruppo -OH reattivo attaccato all'anello aromatico) delle molecole di estrogeno.

I reagenti di derivatizzazione riportati includono:

• Pentafluorobenzile (PFB)
• Piridil-3-solfonile (PS)
• Dansile (D)
• 2-Picolinoile (P)
• N-metil-2-piridinile (NMP)
• N-metil-nicotinoile (NMN)
• 1-(2,4-dinitro-5-fluorofenil)-4,4-dimetilpiperazinile (MPPZ)
• 3-pentafluorobenzil-17β-piridinio (PFBPY)
• 1,2-dimetilimidazolo-5-solfonil cloruro (DMIS)

La maggior parte di questi derivati (PFB, PNB, PS, D e P) non porta una carica elettrica sulla molecola, il che limita la loro capacità di raggiungere limiti di rilevamento bassi di pg/mL. Inoltre, poiché gli estrogeni sono chimicamente simili tra loro, questi derivati tendono a produrre pattern di frammentazione non specifici, causando una scarsa specificità analitica.

I derivati che trasportano una carica permanente — MP, NMN, MPPZ, PFBPY e DMIS — sono molto più adatti a raggiungere una sensibilità dell'ordine dei pg/mL. Ma l'approccio più potente finora è arrivato dal laboratorio degli stessi autori: il derivato NMPS (N-metil piridinio-3-sulfonile). Questa procedura di derivatizzazione pre-ionizzata converte l'E2 e i suoi metaboliti in molecole a carica permanente. Con un LLOQ di 1,0 fg in colonna con un volume di iniezione di 1 μL, consente la quantificazione assoluta degli estrogeni non coniugati in campioni di siero di donne in postmenopausa e uomini anziani. Poiché la derivatizzazione avviene sul gruppo ossidrilico fenolico — una caratteristica condivisa da tutti gli estrogeni — questo metodo può essere generalizzato per misurare tutti gli estrogeni.

Con qualsiasi analisi ad alta sensibilità, i ricercatori devono esercitare estrema cautela. Quantità minime di contaminazione, il trasporto residuo da un'iniezione precedente o l'interferenza di fondo dei materiali di processazione possono compromettere la qualità dei dati. È particolarmente importante utilizzare una matrice bianca appropriata (un campione privo di estrogeni) per verificare il fondo del sistema dovuto a provette, solventi di estrazione, tamponi di derivatizzazione e allo strumento stesso.

Non si tratta di una preoccupazione teorica. Durante il loro lavoro, gli autori hanno scoperto inaspettatamente che alcune provette di vetro causavano un'interferenza sul segnale dell'E2 equivalente a circa 10 pg/mL nel siero durante l'idrolisi enzimatica — una quantità abbastanza grande da invalidare completamente i risultati in una popolazione in cui i livelli normali di E2 sono inferiori a 5 pg/mL.

Separazione cromatografica: distinguere molecole simili

Nella quantificazione degli estrogeni basata su LC-SRM/MS, l'interferenza derivante da composti isobarici — molecole con la stessa massa che non sono l'estrogeno bersaglio — può essere un problema critico. Queste interferenze isobariche possono provenire da fonti esogene (esterne all'organismo) o da composti endogeni (naturalmente presenti nell'organismo), inclusi altri steroidi.

Purtroppo, gli estrogeni e i loro metaboliti tendono a formare ioni prodotto simili quando vengono frammentati nella spettrometria di massa tandem (MS/MS). Ad esempio, quando si analizzano i derivati dansilici, lo ione prodotto m/z 171 (un rapporto massa/carica specifico) viene comunemente selezionato come quantificatore o qualificatore per tutti gli estrogeni e i loro metaboliti, poiché origina dal gruppo dansilico stesso. Questa universalità diventa un problema: se l'E1 e i suoi metaboliti non vengono separati cromatograficamente dall'E2 e dai suoi metaboliti, può verificarsi una sovrastima dell'E2 non coniugato — in particolare poiché l'E1 non coniugato è di solito 2–3 volte più alto dell'E2 in concentrazione.

Ancora più impegnativa è la quantificazione accurata dei singoli isomeri degli estrogeni catecolici — nello specifico 2- e 4-OH-E1, 2- e 4-OH-E2 e i loro corrispondenti metaboliti metossilati — perché questi isomeri sono estremamente simili nella struttura e devono essere separati l'uno dall'altro cromatograficamente.

I ricercatori hanno sviluppato diverse strategie per affrontare questo problema:

• Aumentare la capacità di picco (la capacità di separare molti composti in una singola corsa)
• Ottimizzare l'eluizione in gradiente (modificando gradualmente la composizione del solvente nel tempo)
• Utilizzare particelle di fase stazionaria più piccole — sempre più spesso vengono utilizzate particelle sub-2 μm per migliorare la capacità cromatografica, la sensibilità e la velocità di analisi.

A titolo di esempio, in un recente studio degli autori, 12 metaboliti degli estrogeni sono stati separati con successo su una colonna Waters BEH130 C18 (150 μm × 100 mm, 1,7 μm, 130 Å) entro 45 minuti dopo derivatizzazione con piridinio solfonile. Ciò includeva quattro estrogeni catecolici (4-OHE1, 2-OHE1, 4-OHE2, 2-OHE2) e quattro MeO-estrogeni (4-MeOE1, 2-MeOE1, 4-MeOE2, 2-MeOE2).

Effetti matrice: il problema nascosto delle interferenze

Il siero e il plasma umani sono miscele biologiche complesse. Contengono componenti come fosfolipidi e sali che possono aumentare o sopprimere l'efficienza di ionizzazione degli estrogeni — il che significa che possono rendere il segnale degli estrogeni più forte o più debole di quanto dovrebbe essere. Questi "effetti matrice" sono stati definiti il potenziale "tallone d'Achille" dell'analisi di campioni biologici basata su LC-MS/MS.

In un riscontro particolarmente problematico, Keski-Rahkonen e colleghi hanno riscontrato effetti matrice quando i saggi basati su LC-MS venivano eseguiti in provette o piastre a pozzetti di plastica — un materiale di laboratorio comune che potrebbe introdurre variabilità inaspettata.

Un pericolo sottile: i composti co-eluenti (sostanze che escono dalla colonna cromatografica nello stesso momento dell'estrogeno bersaglio) potrebbero non essere sempre visibili negli intervalli o nelle transizioni monitorate. Questo fenomeno è noto come "picchi fantasma" — interferenze invisibili che possono corrompere silenziosamente i risultati.

Per l'analisi degli estrogeni, l'ionizzazione elettrospray in modalità positiva (ESI) è il metodo di ionizzazione più ampiamente utilizzato dopo la derivatizzazione. Tuttavia, è stato sostenuto che l'ESI è più suscettibile alla soppressione ionica rispetto all'ionizzazione chimica a pressione atmosferica (APCI). È interessante notare che la ricerca ha dimostrato che l'E2 non derivatizzato presentava un aumento di sensibilità di almeno 10 volte in modalità negativa ESI rispetto alla fotoionizzazione a pressione atmosferica (APPI) in modalità positiva, e non soffriva di interferenze da parte di composti isobarici co-eluenti.

Esistono tre strategie generali per valutare gli effetti matrice:

1. Infusione post-colonna: infusione continua dell'analita nello spettrometro di massa mentre si inietta un campione di matrice bianca per osservare le variazioni del segnale.
2. Aggiunta post-estrazione: aggiunta di una quantità nota di analita alla matrice bianca estratta e confronto con la soluzione pura.
3. Confronto delle pendenze delle curve di calibrazione: Confronto della pendenza di una curva di calibrazione preparata in matrice con una preparata in soluzione pura.

Secondo le linee guida FDA del 2013, è necessario adottare misure appropriate per garantire l'assenza di effetti matrice durante l'applicazione del metodo, soprattutto se la matrice utilizzata per i lotti di produzione differisce da quella utilizzata durante la validazione del metodo. I criteri di accettazione richiedono che il valore misurato rientri nell'intervallo di scostamento del 15% rispetto al valore nominale, mentre il coefficiente di variazione (CV, una misura della dispersione dei risultati) deve essere inferiore al 15%.

Diversi approcci possono ridurre gli effetti matrice nella quantificazione degli estrogeni:

• Migliorare la procedura di preparazione del campione
• Ottimizzare la separazione cromatografica
• Utilizzare standard interni marcati con isotopi stabili

Ma anche gli standard interni richiedono un'attenta considerazione. I ricercatori devono prestare attenzione quando utilizzano standard interni analoghi [²H] (marcati con deuterio), perché uno spostamento del tempo di ritenzione tra composti non marcati e composti marcati con deuterio può essere analiticamente significativo, portando a una soppressione differenziale dei segnali dell'analita e dello standard interno. Idealmente, come standard interni dovrebbero essere utilizzati analoghi contenenti [¹³C] (marcati con carbonio-13) degli analiti target, perché co-eluisono esattamente in tutte le condizioni cromatografiche. Eliminano inoltre la possibilità di scambio di deuterio in solventi protici (contenenti acqua). Con la migliore risoluzione cromatografica fornita da particelle sub-2 μm, potrebbe verificarsi una maggiore separazione tra gli analiti e i loro corrispondenti analoghi deuterati, riducendo ulteriormente l'efficacia dello standard interno.

Implicazioni cliniche: cosa significa per i pazienti

Questi progressi tecnici non sono semplici esercizi accademici: hanno implicazioni dirette per la cura dei pazienti. Per le donne in postmenopausa che assumono inibitori dell'aromatasi per il trattamento del carcinoma mammario, conoscere i loro livelli reali di estrogeni aiuta gli oncologi a determinare se il farmaco sta funzionando efficacemente. Per i bambini sottoposti a valutazione per pubertà precoce o ritardata, misurazioni accurate degli estrogeni guidano le decisioni terapeutiche che possono influenzare la crescita e lo sviluppo.

Per gli uomini più anziani, i livelli di estrogeni sono sempre più riconosciuti come rilevanti per il rischio di carcinoma prostatico e per la salute delle ossa. E per le donne in postmenopausa, una valutazione accurata dell'esposizione agli estrogeni è fondamentale per valutare il rischio di carcinoma mammario e per selezionare strategie preventive appropriate.

I metodi ultra-sensibili descritti in questa revisione, in particolare l'approccio di derivatizzazione NMPS che richiede solo 0,1 mL di siero, consentono una misurazione accurata a livelli precedentemente non rilevabili. Questo apre la porta a un migliore monitoraggio clinico e a una ricerca più affidabile su come gli ormoni influenzano il rischio di malattia nel corso della vita. La capacità di misurare 12 diversi metaboliti degli estrogeni in una singola corsa di 45 minuti, da una singola goccia di sangue, rappresenta un miglioramento notevole rispetto ai tempi in cui ogni estrogeno richiedeva un immunodosaggio separato con accuratezza discutibile.

Limiti dell'approccio attuale

Nonostante questi progressi, rimangono limiti significativi. In primo luogo, la valutazione degli effetti matrice è più complicata per l'analisi degli estrogeni perché una matrice bianca adatta, ovvero un campione noto per essere completamente privo di estrogeni, non è facilmente disponibile. L'approccio generale consiste nel preparare standard di calibrazione e campioni di controllo qualità in matrici surrogate come il siero trattato con carbone attivo. Tuttavia, il processo di trattamento con carbone attivo può rimuovere componenti dei campioni reali che causano effetti matrice, il che significa che gli standard di calibrazione potrebbero non rappresentare pienamente i campioni reali dei pazienti.

In secondo luogo, gli standard interni marcati con isotopi, nonostante il loro nome, potrebbero non correggere sempre perfettamente tutte le fonti di variazione, in particolare se i composti marcati con deuterio si spostano nel tempo di ritenzione e subiscono una soppressione della ionizzazione diversa rispetto agli estrogeni naturali.

In terzo luogo, la valutazione dell'efficienza di idrolisi tra i campioni rimane difficile a causa della mancanza di standard autentici e di standard isotopici stabili per tutte le forme coniugate. La frustrazione di misurare i coniugati intatti è aggravata dalla disponibilità commerciale molto limitata degli standard di riferimento necessari: attualmente è disponibile per l'acquisto solo una delle cinque forme di E2 solfato.

Infine, le preparazioni enzimatiche utilizzate per l'idrolisi possono introdurre fattori confondenti. L'enzima comunemente usato Helix pomatia è contaminato da attività 3β-HSD, che potrebbe interferire se nello stesso campione vengono misurati anche gli androgeni. Inoltre, alcuni metaboliti degli estrogeni non coniugati in circolo hanno concentrazioni inferiori al limite inferiore di quantificazione anche di questi metodi avanzati.

Raccomandazioni per ricercatori e clinici

Sulla base della loro vasta esperienza, gli autori offrono le seguenti raccomandazioni pratiche per chiunque conduca analisi degli estrogeni ad altissima sensibilità:

1. Pre-testare tutti i materiali di consumo: Provette, reagenti ed enzimi devono essere pre-testati per garantire che non introducano contaminazione o interferenze. La scoperta degli autori stessi che le provette di vetro potevano contribuire con un segnale estrogeno-simile equivalente a 10 pg/mL è un racconto ammonitore.
2. Utilizzare MTBE per l'estrazione liquido-liquido: Ha dimostrato il recupero più completo degli ormoni steroidei testati rispetto a etere dietilico, esano e 2-metilbutano.
3. Scelga reagenti di derivatizzazione pre-ionizzati: i derivati NMPS forniscono cariche permanenti che raggiungono la massima sensibilità (1,0 fg in colonna) derivatizzando al gruppo ossidrile fenolico, rendendo il metodo applicabile a tutti gli estrogeni.
4. Ottimizzi la separazione cromatografica con colonne a particelle inferiori a 2 μm: queste forniscono la risoluzione necessaria per separare catecoli isomerici e metossi-estrogeni che altrimenti causerebbero errori di sovrastima.
5. Preferisca standard interni marcati con ¹³C: co-eluendo esattamente con gli analiti target in tutte le condizioni cromatografiche, eliminano i problemi di spostamento del tempo di ritenzione associati alle marcature con deuterio.
6. Consideri l'analisi dei coniugati intatti: questo evita del tutto i problemi di idrolisi, sebbene sia attualmente limitato dalla disponibilità di standard di coniugati.
7. Conduca una validazione approfondita del metodo: confermi sensibilità, specificità e riproducibilità del dosaggio prima di analizzare campioni clinici, seguendo le linee guida FDA con criteri di accettazione di ±15% di bias e CV inferiore al 15%.
8. Sia consapevole dei limiti della matrice surrogata: il siero trattato con carbone attivo potrebbe non imitare completamente i campioni reali dei pazienti, quindi i risultati dovrebbero essere interpretati con la dovuta cautela.

Queste raccomandazioni sono particolarmente rilevanti per i laboratori clinici e i gruppi di ricerca che lavorano con campioni di uomini anziani, bambini, donne in postmenopausa e donne in trattamento con inibitori dell'aromatasi — popolazioni in cui una misurazione accurata e ultra-sensibile degli estrogeni può influenzare direttamente la diagnosi, le decisioni terapeutiche e gli esiti per i pazienti.

Domande frequenti

Perché è così difficile misurare gli estrogeni nelle persone con livelli molto bassi?

In gruppi come le donne in postmenopausa, gli uomini anziani e i bambini, i livelli di estrogeni possono essere inferiori a 5 picogrammi per millilitro, spesso 100 volte più bassi rispetto agli adulti. Quantità così piccole sono difficili da rilevare perché le molecole di estrogeni non si ionizzano in modo efficiente negli strumenti di laboratorio standard. I chimici utilizzano modifiche chimiche speciali e una spettrometria di massa estremamente sensibile per misurarle con precisione.

Quali erano i principali problemi dei vecchi test per gli estrogeni (immunodosaggi)?

I vecchi test che utilizzavano anticorpi spesso presentavano reattività crociata con molecole simili, fornendo letture imprecise. I risultati variavano tra i laboratori e ogni test poteva misurare un solo estrogeno alla volta. La misurazione di più prodotti di degradazione degli estrogeni richiedeva molti test separati, rendendo il processo lento e inaffidabile per i livelli bassi.

Quanto sono accurati i moderni metodi di spettrometria di massa per il dosaggio degli estrogeni?

Le tecniche moderne che utilizzano la diluizione isotopica con isotopi stabili e la cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa sono ampiamente considerate il gold standard. Offrono una migliore specificità, un'elevata accuratezza e possono misurare più estrogeni contemporaneamente. Aggiungendo una quantità nota di estrogeno marcato, gli scienziati confrontano i segnali per calcolare i livelli naturali esatti, correggendo molti errori dei metodi precedenti.

Cosa significa un test degli estrogeni ultra-sensibile per una donna che assume inibitori dell'aromatasi?

Per le donne in postmenopausa con carcinoma mammario in trattamento con inibitori dell'aromatasi, conoscere con precisione i livelli reali di estrogeni aiuta gli oncologi a capire se il farmaco sta funzionando. I vecchi test potrebbero non aver rilevato livelli molto bassi. I test ultra-sensibili possono misurare gli estrogeni da una singola goccia di sangue, offrendo un monitoraggio più affidabile dell'efficacia del trattamento.

Perché una misurazione accurata degli estrogeni è importante per i bambini con problemi di pubertà?

Nei bambini valutati per pubertà precoce o ritardata, i livelli di estrogeni guidano le decisioni terapeutiche che possono influenzare la crescita e lo sviluppo. I livelli di estrogeni nei bambini possono essere circa 100 volte inferiori rispetto ai livelli degli adulti, rendendoli difficili da misurare. I metodi avanzati ora consentono una misurazione accurata da campioni di sangue molto piccoli, aiutando i medici a fornire cure appropriate.

Quanto sangue è necessario per il test degli estrogeni ultra-sensibile?

Alcuni metodi avanzati richiedono solo 0,1 millilitri di siero, circa una singola goccia di sangue. Ad esempio, un metodo che utilizza la derivatizzazione con N-metil piridinio-3-solfonile ha raggiunto un'elevata sensibilità con soli 0,1 mL. Un metodo precedente richiedeva 0,5 mL. Requisiti di campione più piccoli rendono il test più semplice per i bambini e i pazienti fragili.

Quali sono i vantaggi dei nuovi test per gli estrogeni rispetto ai test più datati?

I nuovi test possono misurare fino a 12 diversi metaboliti degli estrogeni in una singola analisi di 45 minuti a partire da una singola goccia di sangue. Forniscono un'accuratezza molto migliore a livelli molto bassi, evitano problemi di reattività crociata e forniscono risultati affidabili per guidare il trattamento di condizioni come il carcinoma mammario, i disturbi della pubertà e il rischio di carcinoma prostatico. Ciò migliora il monitoraggio clinico e la ricerca.

Dovrei richiedere un secondo parere sui risultati del mio test degli estrogeni se sono una donna in postmenopausa o un uomo anziano con livelli di estrogeni molto bassi?

Sì, un secondo parere può essere prezioso perché i test immunodosaggi più datati spesso fornivano letture imprecise a causa della reattività crociata, e i risultati variavano tra i laboratori. I moderni metodi di spettrometria di massa sono il gold standard e possono misurare con precisione livelli di estrogeni molto bassi, inferiori a 5 pg/mL, utilizzando una singola goccia di sangue. Se il test è stato eseguito con un metodo più datato, un secondo parere che utilizzi tecniche avanzate può fornire risultati più affidabili, il che è importante per il monitoraggio della terapia con inibitori dell'aromatasi o per la valutazione del rischio di cancro. Diagnostic Detectives Network fornisce secondi pareri indipendenti da parte di esperti.

Fonte delle informazioni

Questo articolo divulgativo si basa su una ricerca sottoposta a revisione paritaria pubblicata sul Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology.

Original article title: Ultra-high sensitivity analysis of estrogens for special populations in serum and plasma by liquid chromatography-mass spectrometry

Authors: Qingqing Wang, Clementina Mesaros, and Ian A. Blair

Publication details: J Steroid Biochem Mol Biol. 2016 September; 162: 70–79. doi:10.1016/j.jsbmb.2016.01.002 (Published in final edited form as an HHS Public Access author manuscript, available in PMC 2017 September 01)

Affiliations: Center of Excellence in Environmental Toxicology and Penn SRP Center, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA; Department of Systems Pharmacology and Translational Therapeutics, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania; Department of Pharmacology and Toxicology, Beijing Institute of Radiation Medicine, Beijing, China.

Nota: Questo articolo spiega il contenuto tecnico della revisione scientifica originale in un linguaggio accessibile ai pazienti. È inteso a scopo educativo e non costituisce un consiglio medico. I pazienti con domande sui test degli estrogeni o su condizioni correlate agli ormoni devono consultare il proprio medico curante.