Atteindre une sensibilité ultra-élevée dans le dosage des œstrogènes : un guide pour une mesure précise chez les populations spéciales présentant de faibles niveaux hormonaux

Table des matières

• Points clés
• Pourquoi la mesure des œstrogènes est importante
• Comment les œstrogènes sont traités dans l'organisme
• Le défi particulier : les populations avec des taux très faibles d'œstrogènes
• La méthode de référence : la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse
• Préparation de l'échantillon : se préparer à l'analyse
• Dérivation : augmenter la sensibilité par la chimie
• Séparation chromatographique : distinguer les molécules similaires
• Effets de matrice : le problème caché des interférences
• Implications cliniques : ce que cela signifie pour les patients
• Limites de l'approche actuelle
• Recommandations pour les chercheurs et les cliniciens
• Questions fréquemment posées
• Informations sur la source

Points clés

• Les anciens immunodosages des œstrogènes donnaient souvent des lectures inexactes en raison de la réactivité croisée avec des molécules similaires.
• La dilution par isotopes stables couplée à la chromatographie liquide et à la spectrométrie de masse est le standard d'or pour la mesure des œstrogènes.
• Chez les femmes ménopausées et les hommes âgés, les taux d'œstrogènes sont souvent inférieurs à 5 pg/mL, ce qui nécessite des méthodes ultra-sensibles.
• Une méthode utilisant la dérivation par NMPS ne nécessite que 0,1 mL de sérum et permet de mesurer cinq œstrogènes avec une grande sensibilité.
• La contamination provenant des fournitures de laboratoire, telles que les tubes en verre, peut faussement augmenter les résultats d'œstrogènes et doit être vérifiée.

Pourquoi la mesure des œstrogènes est importante

La mesure des œstrogènes est une pierre angulaire de l'endocrinologie moderne. Elle joue un rôle crucial dans l'évaluation clinique de nombreux troubles endocriniens (liés aux hormones), ainsi que dans la recherche sur l'influence des hormones sur la biologie humaine et les maladies. Pendant près de 30 ans, les scientifiques et les cliniciens se sont fiés aux radioimmunodosages (RIA) conventionnels ou aux immunodosages enzymatiques directs pour mesurer les taux circulants d'œstrogènes.

Ces anciennes méthodes offraient une bonne sensibilité, mais elles présentaient un inconvénient majeur : un manque de spécificité. Les anticorps utilisés dans les immunodosages réagissent souvent de manière croisée avec d'autres stéroïdes — des molécules chimiquement similaires aux œstrogènes — ce qui entraîne des lectures inexactes. Cette réactivité croisée a posé d'importants problèmes lors de l'interprétation des données des études épidémiologiques, et les résultats ont souvent varié d'un laboratoire à l'autre.

Une autre limitation majeure des méthodes basées sur les immunodosages est qu'elles ne peuvent mesurer qu'un seul analyte à la fois. Pour mesurer tous les métabolites (produits de dégradation) d'un seul œstrogène, les chercheurs doivent effectuer plusieurs dosages séparés, ce qui est chronophage et inefficace. Au cours de la dernière décennie, cependant, des avancées significatives dans une technique appelée dilution par isotope stable (SID) couplée à la chromatographie liquide–suivi de réaction sélectionnée–spectrométrie de masse (LC-SRM/MS) ont offert une solution puissante à ces problèmes.

Pourtant, même avec cette technologie avancée, un défi reste de taille : quantifier les œstrogènes et leurs métabolites dans les échantillons de sérum et de plasma de populations présentant des taux d'œstrogènes extrêmement faibles. Cela inclut les hommes âgés, les enfants, les femmes ménopausées et les femmes recevant des inhibiteurs de l'aromatase pour le traitement du cancer du sein. Cet article, rédigé par des chercheurs de la Perelman School of Medicine de l'Université de Pennsylvanie et de l'Institut de médecine nucléaire de Pékin, examine les questions spécifiques liées à l'utilisation de la méthodologie SID LC-SRM/MS ultra-sensible pour ces échantillons difficiles, et suggère les meilleures pratiques à chaque étape du processus analytique.

Comment les œstrogènes sont traités dans le corps

Comprendre comment les œstrogènes se comportent dans le corps aide à expliquer pourquoi leur mesure est si importante. De nombreuses études cliniques et expérimentales ont montré que des taux d'œstrogènes relativement élevés dans le sang des femmes sont associés à un risque accru de cancer du sein, de cancer de l'endomètre et de cancer de l'ovaire — bien qu'il soit notable que beaucoup de ces études aient utilisé des dosages RIA dont la validité est contestée. Chez les hommes, une augmentation des œstrogènes circulants est également un facteur de risque potentiel pour le cancer de la prostate.

La capacité à mesurer avec précision l'estradiol (E2) et la testostérone (T) chez les enfants s'est révélée cruciale pour diagnostiquer et traiter les troubles de la puberté et du développement sexuel. Certaines études ont également montré que des taux d'œstrogènes plus élevés à un âge précoce sont corrélés au début du développement mammaire chez les filles, suggérant que les hormones pendant le développement pourraient moduler le risque de maladie plus tard dans la vie.

Les œstrogènes agissent par deux voies principales : les mécanismes dépendants du récepteur des œstrogènes (ER) et les mécanismes indépendants de l'ER. La voie dépendante de l'ER implique une stimulation directe de la prolifération cellulaire anormale, qui est causalement liée au développement du cancer du sein. Les effets cancérigènes (provoquant un cancer) indépendants de l'ER sont censés se produire par l'action de métabolites d'œstrogènes génotoxiques — ou endommageant l'ADN.

Voici comment ce processus fonctionne :

1. Les œstrogènes parents subissent un métabolisme oxydatif (modification chimique par des enzymes) via les enzymes cytochrome P450 (CYP) 1B1 et CYP3A4.
2. Ce processus forme deux types de métabolites d'œstrogènes catécholiques (une structure chimique avec deux groupes hydroxyle adjacents) : les 2,3-catéchols (2-OH-E1 et 2-OH-E2) et les 3,4-catéchols (4-OH-E1 et 4-OH-E2).
3. La CYP1B1 montre une régiosélectivité considérable — une préférence de 9:1 — pour la formation de 4-OH-E1 et 4-OH-E2 par rapport aux formes hydroxylées en position 2.
4. La recherche suggère que les 4-OH-E1 et 4-OH-E2 sont plus génotoxiques (endommageant l'ADN) que les métabolites correspondants 2-OH-E1 et 2-OH-E2.

Il est intéressant de noter que tous les métabolites d'œstrogènes ne sont pas nocifs. Le 2-OH-E2 est un inhibiteur puissant de l'aromatase (une enzyme qui convertit les androgènes en œstrogènes), et le 2-OH-E1 est associé à un risque réduit de cancer du sein positif aux récepteurs des œstrogènes (ER+) chez les femmes préménopausées, après ajustement pour les concentrations circulantes d'estrone (E1). Les deux catéchols sont rapidement convertis par une enzyme appelée catéchol-O-méthyl transférase (COMT) en métabolites méthoxy (OMe). Il est notable que le 2-OMe-E2 possède une activité anti-proliférative significative, ce qui signifie qu'il aide à empêcher les cellules de se multiplier de manière incontrôlée.

Les œstrogènes et leurs métabolites hydroxylés sont également facilement modifiés par l'ajout de groupes glucuronide, sulfate ou glutathion (GSH), formant des métabolites d'œstrogènes conjugués. Les conjugaisons d'œstrogènes circulantes les plus abondantes sont les sulfates, qui peuvent servir de précurseurs d'œstrogènes dans le tissu mammaire par l'action des stéroïdesulfatases. Les androgènes circulants peuvent également servir de précurseurs d'œstrogènes chez les femmes préménopausées par l'action de l'aromatase — fournissant une source fondamentalement différente d'œstrogènes par rapport aux femmes préménopausées.

En raison de ces effets variés et de ces voies métaboliques, les œstrogènes et leurs métabolites dans le sang sont des biomarqueurs précieux — indicateurs biologiques — de la biosynthèse et du métabolisme tissulaires des œstrogènes.

Le défi particulier : les populations avec des niveaux d'œstrogènes très faibles

Pour la plupart des adultes en âge de procréer, les niveaux d'œstrogènes sont suffisamment élevés pour être mesurés par des techniques standard. Mais certains groupes présentent un défi analytique redoutable car leurs niveaux d'œstrogènes sont extraordinairement bas.

Les concentrations sériques typiques d'E2 non conjuguée chez les femmes ménopausées et les hommes âgés sont souvent inférieures à 5 pg/mL (picogrammes par millilitre — un picogramme est un trillionième de gramme). Pour comparaison, les niveaux d'E1 non conjuguée dans ces groupes varient de 11,8 à 37,4 pg/mL. Les niveaux d'E2 dans les études cliniques de pédiatrie endocrinologique ont été signalés comme étant environ 100 fois plus faibles que ceux des adultes, les niveaux les plus bas se produisant aux stades prépubères (avant la puberté).

Ces niveaux en pg/mL sont extrêmement difficiles pour la plupart des dosages basés sur la chromatographie liquide-spectrométrie de masse (LC-MS). Pour aggraver les choses, d'autres métabolites d'œstrogènes non conjugués — tels que les méthoxy-œstrogènes (MeO-œstrogènes) ou les catéchols — sont présents à des concentrations encore plus faibles, généralement en dessous de la limite inférieure de quantification (LLOQ, la plus petite quantité qui peut être mesurée de manière fiable) de la plupart des dosages LC-MS standard.

Le défi de sensibilité provient principalement des faibles efficacités d'ionisation des œstrogènes non conjugués et de leurs métabolites — ce qui signifie qu'ils n'acquièrent pas facilement la charge électrique nécessaire pour que la spectrométrie de masse les détecte. C'est pourquoi les scientifiques ont développé de nombreuses stratégies de dérivatisation (modifications chimiques) pour améliorer l'ionisation et augmenter la sensibilité. Ces stratégies aident également souvent au nettoyage des échantillons.

Il est en fait plus facile de mesurer les œstrogènes totaux (formes non conjuguées plus formes conjuguées) après hydrolyse ou solvolyse (décomposition chimique utilisant de l'eau ou de l'alcool), car les niveaux d'œstrogènes totaux sont au moins 2 à 3 fois supérieurs aux niveaux d'œstrogènes non conjugués. Cependant, évaluer l'efficacité et l'uniformité de l'hydrolyse entre les échantillons reste problématique et peut produire des résultats erronés, car les standards authentiques et les standards isotopiques stables ne sont pas toujours disponibles pour tous les conjugués d'œstrogènes.

La méthode de référence : la chromatographie liquide-spectrométrie de masse

La méthodologie de dilution par isotopes stables (SID) combinée à la chromatographie liquide–surveillance de réactions sélectionnées–spectrométrie de masse (LC-SRM/MS) est désormais largement acceptée comme la « méthode de référence » pour quantifier les œstrogènes et leurs métabolites dans le sérum et le plasma. Par rapport aux immunodosages, cette approche offre une spécificité améliorée, une grande précision et la capacité de surveiller plusieurs œstrogènes simultanément.

Le principe fonctionne comme suit : les chercheurs ajoutent une quantité connue d'une version « lourde » (étiquetée par un isotope) de chaque œstrogène à l'échantillon du patient. Parce que les versions étiquetées et non étiquetées se comportent identiquement lors de l'extraction et de l'analyse, les chercheurs peuvent calculer la quantité exacte d'œstrogène naturel présent en comparant les deux signaux. Cette approche auto-corrective élimine beaucoup des erreurs qui affectent les méthodes plus anciennes.

Une ultra-haute sensibilité peut être obtenue lorsque les molécules d'œstrogènes sont converties en dérivés « pré-ionisés » (formes chimiquement modifiées qui portent déjà une charge) et analysées à l'aide de spectromètres de masse à triple quadripôle en mode surveillance de réactions sélectionnées (SRM), couplés à la chromatographie liquide à nanodébit (une technique qui utilise des débits extrêmement faibles).

Deux méthodes marquantes démontrent la puissance de cette approche :

• 2011 — Méthode du dérivé GP (Girard P) : Utilisée pour l'analyse de l'E1 et de ses métabolites. A permis aux chercheurs d'utiliser seulement 0,5 mL de sérum. La LLOQ pour chaque œstrogène était de 0,156 pg/mL (15,6 femtogrammes [fg] sur colonne) — un femtogramme est un quadrillionième de gramme.
• 2015 — Méthode du dérivé N-méthyl pyridinium-3-sulfonyl (NMPS) : Utilisée pour l'E2 et ses métabolites. Nécessitait seulement 0,1 mL de sérum — une seule goutte — tout en atteignant une sensibilité étonnante de 1,0 fg sur colonne pour cinq œstrogènes et leurs métabolites.

Préparation des échantillons : se préparer à l'analyse

Avant que toute mesure d'œstrogène puisse avoir lieu, l'échantillon doit être préparé. Cela implique généralement une extraction (séparation des œstrogènes des autres composants sanguins), un nettoyage et une concentration. Il existe deux approches principales pour gérer les œstrogènes conjugués : ils peuvent être décomposés en formes non conjuguées par hydrolyse avant l'analyse, ou mesurés sous forme de conjugués intacts.

L'hydrolyse convertit les conjugués en formes non conjuguées, ce qui augmente leur concentration dans l'échantillon. Après hydrolyse, l'extraction liquide-liquide (ELL) ou l'extraction en phase solide (EPS) peut extraire efficacement les œstrogènes du sérum et du plasma.

Extraction liquide-liquide (ELL) : L'ELL est peu coûteuse, rapide et souvent la méthode d'extraction principale pour l'analyse des œstrogènes. Ses inconvénients incluent le fait qu'elle est laborieuse, chronophage et plus difficile à automatiser que l'EPS. Les solvants les plus couramment utilisés sont l'éther méthyl-tert-butyle (MTBE), l'éther diéthylique, le dichlorométhane ou des mélanges de solvants organiques. Le MTBE peut extraire à la fois les œstrogènes non conjugués du sérum et les dérivés d'œstrogènes du tampon de dérivatisation.

Une enquête approfondie par Keski-Rahkonen et ses collègues a comparé l'efficacité d'extraction du MTBE, de l'éther diéthylique, de l'hexane et du 2-méthylbutane à partir d'échantillons de sérum. L'étude a montré que l'ELL avec MTBE récupérait entièrement les hormones stéroïdiennes testées, contrairement aux autres solvants, ce qui en fait le choix préféré.

Extraction en phase solide (EPS) : L'EPS hors-ligne ou en-ligne couplée à la LC-MS est une technique très prometteuse pour l'analyse semi-automatisée des échantillons. Les avantages de l'EPS en-ligne incluent un temps d'analyse plus court, des bandes chromatographiques plus concentrées et un risque de contamination considérablement réduit.

Une étude notable par Zhao et ses collègues a rapporté une méthode LC-MS pour déterminer 12 œstrogènes non conjugués et leurs conjugués intacts dans le sang et l'urine. Cette méthode utilisait une seule étape d'EPS à la fois pour les œstrogènes non conjugués et leurs conjugués : après avoir chargé les échantillons sur une cartouche Oasis HLB (équilibre hydrophile-lipophile), les œstrogènes non conjugués étaient d'abord élués avec de l'acétate d'éthyle, puis les conjugués étaient élués avec du méthanol contenant 0,1 % d'ammoniaque.

Une étude plus récente a rapporté un processus automatisé en ligne de piégeage et d'élution utilisant une colonne de piégeage à échangeur cationique faible (WCX) à accès restreint (RAM) avec dilution en ligne. Cette approche montre un potentiel pour l'utilisation avec des échantillons provenant d'hommes âgés, d'enfants et de femmes préménopausées car la procédure simplifiée nécessite seulement 100 μL de sérum, atteint une LLOQ de 3 pg/mL et offre une excellente exactitude et précision.

Deux approches pour les œstrogènes conjugués :

La première approche implique l'hydrolyse des conjugués β-glucuronide et sulfate avant l'extraction et la dérivation. L'enzyme la plus couramment utilisée est la β-glucuronidase/arylsulfatase purifiée de l'escargot Helix pomatia. Cette enzyme contient naturellement à la fois des activités β-glucuronidase et sulfatase en quantités presque égales. En revanche, l'enzyme issue d'E. coli ne contient que de la β-glucuronidase et est essentiellement dépourvue d'activité sulfatase.

Cependant, les chercheurs doivent faire preuve de prudence : des preuves montrent que l'extrait de Helix pomatia est contaminé par une activité 3β-hydroxystéroïde déshydrogénase (HSD) ou cholestérol oxydase. Cela pourrait fausser les études dans lesquelles les analytes d'intérêt sont des substrats de la 3β-HSD — un point très important si des androgènes sont analysés dans le même échantillon.

Des expériences avec des conjugués sulfates d'œstrogènes synthétisés ont révélé une autre limitation critique : seule la forme 3-sulfate est clivée par hydrolyse enzymatique ; le groupe 17-sulfate y est résistant. Une alternative prometteuse implique la solvolyse des conjugués en utilisant de l'hydrochlorure d'hydrogène méthanolé anhydre — une approche publiée pour la première fois par Tang et Crone en 1989 et ensuite utilisée par plusieurs groupes de recherche. Étonnamment, cette méthode ne semble pas avoir été appliquée à des échantillons de sérum et de plasma provenant d'hommes âgés, d'enfants et de femmes préménopausées.

La deuxième approche consiste à analyser le conjugué intact par spectrométrie de masse en mode ion négatif, sans hydrolyse enzymatique ni dérivation. Des études récentes ont observé que la concentration totale d'E1 chez les femmes préménopausées varie de 61,3 à 442,1 pg/mL, incluant l'E1 sulfate avec une concentration moyenne de 244,8 pg/mL. Ces niveaux plus élevés d'E1 glucuronide ou d'E1 sulfate pourraient être quantifiés relativement facilement par LC-MS. L'E1 sulfate dans le sérum peut être efficacement extrait à l'aide de cartouches Oasis HLB ou d'échangeurs anioniques faibles (WAX) et élué avec de l'acétate d'ammonium ou de l'hydroxyde d'ammonium.

Cette approche du conjugué intact est prometteuse mais fait face à un obstacle majeur : le manque de standards authentiques de conjugués d'œstrogènes et d'analogues lourds stables pour servir de standards internes. Par exemple, un seul des cinq sulfates possibles de l'E2 (3-sulfate, 17-sulfate, 3-sulfate 17-glucuronide, 3-glucuronide 17-sulfate et 3,17-bis-sulfate) est actuellement disponible dans le commerce : 17β-E2-2,4,6-[²H]₄-3-sulfate.

Dérivation : Augmenter la sensibilité par la chimie

Parce que les œstrogènes non conjugués existent à des concentrations extrêmement faibles dans le sang des hommes âgés, des enfants et des femmes préménopausées, la mesure fiable nécessite actuellement une dérivation — l'attachement d'un groupe chimique à la molécule d'œstrogène pour améliorer sa capacité à être détectée. De nombreux réactifs de dérivation chimique ont été développés à cette fin, ciblant le groupe hydroxyle phénolique (un groupe -OH réactif attaché au cycle aromatique) des molécules d'œstrogènes.

Les réactifs de dérivation rapportés incluent :

• Pentafluorobenzyle (PFB)
• Pyridyl-3-sulfonyl (PS)
• Dansyle (D)
• 2-Picolinoyl (P)
• N-méthyl-2-pyridinyle (NMP)
• N-méthylnicotinoyl (NMN)
• 1-(2,4-dinitro-5-fluorophényl)-4,4-diméthylpipérazinyle (MPPZ)
• 3-pentafluorobenzyl-17β-pyridinium (PFBPY)
• 1,2-diméthylimidazole-5-sulfonyl chloride (DMIS)

La plupart de ces dérivés (PFB, PNB, PS, D et P) ne portent pas de charge électrique sur la molécule, ce qui limite leur capacité à atteindre des limites de détection de l'ordre du pg/mL. De plus, parce que les œstrogènes sont chimiquement similaires les uns aux autres, ces dérivés ont tendance à produire des motifs de fragmentation non spécifiques, entraînant une spécificité analytique médiocre.

Les dérivés qui portent une charge permanente — MP, NMN, MPPZ, PFBPY et DMIS — sont beaucoup mieux adaptés pour atteindre une sensibilité de l'ordre du pg/mL. Mais l'approche la plus puissante à ce jour provient du laboratoire des auteurs : le dérivé NMPS (N-méthyl pyridinium-3-sulfonyl). Cette procédure de dérivation pré-ionisante convertit l'E2 et ses métabolites en molécules portant une charge permanente. Avec une LLOQ de 1,0 fg sur colonne avec un volume d'injection de 1 μL, elle permet la quantification absolue des œstrogènes non conjugués dans les échantillons sériques de femmes ménopausées et d'hommes âgés. Étant donné que la dérivation se produit au niveau du groupe hydroxyle phénolique — une caractéristique partagée par tous les œstrogènes — cette méthode peut être généralisée pour mesurer tous les œstrogènes.

Avec toute analyse à haute sensibilité, les chercheurs doivent faire preuve d'une extrême prudence. De minimes quantités de contamination, un effet de mémoire issu d'une injection précédente ou une interférence de fond provenant des fournitures de traitement peuvent compromettre la qualité des données. Il est particulièrement important d'utiliser une matrice blanche appropriée (un échantillon sans œstrogènes) pour vérifier le bruit de fond du système provenant des tubes, des solvants d'extraction, des tampons de dérivation et de l'instrument lui-même.

Il ne s'agit pas d'une préoccupation théorique. Au cours de leurs propres travaux, les auteurs ont découvert par surprise que certaines tubes en verre causaient une interférence sur le signal de l'E2 équivalente à environ 10 pg/mL dans le sérum lors de l'hydrolyse enzymatique — une quantité suffisamment importante pour invalider complètement les résultats dans une population où les niveaux normaux d'E2 sont inférieurs à 5 pg/mL.

Séparation chromatographique : distinguer des molécules similaires

Dans la quantification des œstrogènes par LC-SRM/MS, les interférences provenant de composés isobariques — des molécules ayant la même masse mais qui ne sont pas l'œstrogène cible — peuvent poser un problème critique. Ces interférences isobariques peuvent provenir de sources exogènes (à l'extérieur du corps) ou de composés endogènes (présents naturellement dans le corps), y compris d'autres stéroïdes.

Malheureusement, les œstrogènes et leurs métabolites ont tendance à former des ions produits similaires lors de la fragmentation en spectrométrie de masse en tandem (MS/MS). Par exemple, lorsque des dérivés dansyl sont analysés, l'ion produit m/z 171 (un rapport masse/charge spécifique) est couramment sélectionné comme quantificateur ou qualificateur pour tous les œstrogènes et leurs métabolites, car il provient du groupe dansyl lui-même. Cette universalité devient un problème : si l'E1 et ses métabolites ne sont pas séparés chromatographiquement de l'E2 et de ses métabolites, une surestimation de l'E2 non conjuguée peut se produire — d'autant plus que l'E1 non conjugué est généralement 2 à 3 fois plus élevé en concentration que l'E2.

Encore plus difficile, la quantification précise des isomères individuels des œstrogènes catécholiques — spécifiquement les 2- et 4-OH-E1, les 2- et 4-OH-E2, et leurs métabolites méthoxy correspondants — car ces isomères sont extrêmement similaires en structure et doivent être séparés les uns des autres chromatographiquement.

Les chercheurs ont développé plusieurs stratégies pour répondre à ce problème :

• Augmentation de la capacité de pics (la capacité de séparer de nombreux composés en une seule analyse)
• Optimisation de l'élution par gradient (modification progressive de la composition du solvant au fil du temps)
• Utilisation de particules de phase stationnaire plus petites — de plus en plus, des particules sub-2 μm sont utilisées pour améliorer la capacité chromatographique, la sensibilité et la rapidité d'analyse.

À titre d'exemple, dans une étude récente réalisée par les auteurs, 12 métabolites des œstrogènes ont été séparés avec succès sur une colonne Waters BEH130 C18 (150 μm × 100 mm, 1,7 μm, 130 Å) en moins de 45 minutes après la dérivation sulfonyl pyridinium. Cela comprenait quatre œstrogènes catécholiques (4-OHE1, 2-OHE1, 4-OHE2, 2-OHE2) et quatre œstrogènes MeO (4-MeOE1, 2-MeOE1, 4-MeOE2, 2-MeOE2).

Effets de matrice : le problème d'interférence caché

Le sérum et le plasma humains sont des mélanges biologiques complexes. Ils contiennent des composants tels que les phospholipides et les sels qui peuvent soit améliorer, soit supprimer l'efficacité d'ionisation des œstrogènes — ce qui signifie qu'ils peuvent rendre le signal des œstrogènes plus fort ou plus faible qu'il ne devrait l'être. Ces « effets de matrice » ont été qualifiés du talon d'Achille potentiel de l'analyse basée sur la LC-MS/MS des échantillons biologiques.

Dans une découverte particulièrement problématique, Keski-Rahkonen et ses collègues ont rencontré des effets de matrice lorsque des dosages basés sur la LC-MS ont été effectués dans des tubes ou des plaques à puits en plastique — un matériau de laboratoire courant qui peut introduire une variabilité inattendue.

Un danger subtil : les composés co-éluants (les substances qui sortent de la colonne chromatographique au même moment que l'œstrogène cible) ne sont pas toujours visibles dans les plages ou transitions surveillées. Ce phénomène est connu sous le nom de « pics fantômes » — des interférences invisibles qui peuvent corrompre silencieusement les résultats.

Pour l'analyse des œstrogènes, l'ionisation par électrospray en mode positif (ESI) est la méthode d'ionisation la plus largement utilisée après la dérivation. Cependant, il a été argumenté que l'ESI est plus susceptible à la suppression d'ion que l'ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI). Fait intéressant, la recherche a montré que l'E2 non dérivée présentait au moins une augmentation de sensibilité de 10 fois en mode négatif ESI par rapport à l'ionisation photochimique à pression atmosphérique (APPI) en mode positif, et ne souffrait pas d'interférence par des composés isobariques co-éluants.

Il existe trois stratégies générales pour évaluer les effets de matrice :

1. Infusion post-colonne : Infusion continue de l'analyte dans le spectromètre de masse tout en injectant un échantillon de matrice blanche afin d'observer les changements de signal.
2. Ajout post-extraction : Ajout d'une quantité connue d'analyte à la matrice blanche extraite et comparaison avec une solution pure.
3. Comparaison des pentes des courbes d'étalonnage : Comparer la pente d'une courbe d'étalonnage préparée dans une matrice à celle préparée dans une solution pure.

Selon les directives de la FDA de 2013, des mesures appropriées doivent être prises pour garantir l'absence d'effets de matrice tout au long de l'application de la méthode, en particulier si la matrice utilisée pour les lots de production diffère de celle utilisée lors de la validation de la méthode. Les critères d'acceptation exigent que la valeur mesurée se situe dans une plage de biais de 15 % par rapport à la valeur nominale, tandis que le coefficient de variation (CV, une mesure de la dispersion des résultats) doit être inférieur à 15 %.

Plusieurs approches peuvent réduire les effets de matrice dans la quantification des œstrogènes :

• Amélioration de la procédure de préparation de l'échantillon
• Optimisation de la séparation chromatographique
• Utilisation d'étalons internes marqués aux isotopes stables

Mais même les étalons internes nécessitent une réflexion attentive. Les chercheurs doivent faire preuve de prudence lors de l'utilisation d'étalons internes analogues [²H] (marqués au deutérium), car un décalage du temps de rétention entre les composés non marqués et ceux marqués au deutérium peut avoir une signification analytique — entraînant une suppression différentielle des signaux de l'analyte et de l'étalon interne. Idéalement, des analogues contenant du [¹³C] (marqués au carbone-13) des analytes cibles devraient être utilisés comme étalons internes car ils co-éluent exactement dans toutes les conditions chromatographiques. Ils éliminent également la possibilité d'un échange de deutérium dans les solvants protiques (contenant de l'eau). Avec la résolution chromatographique améliorée fournie par les particules de sous-2 μm, une séparation plus grande entre les analytes et leurs analogues deutérés correspondants pourrait se produire, réduisant davantage l'efficacité de l'étalon interne.

Implications cliniques : Ce que cela signifie pour les patients

Ces avancées techniques ne sont pas de simples exercices académiques — elles ont des implications directes pour les soins aux patients. Pour les femmes ménopausées prenant des inhibiteurs de l'aromatase pour traiter le cancer du sein, connaître leurs véritables niveaux d'œstrogènes aide les oncologues à déterminer si le médicament est efficace. Pour les enfants en cours d'évaluation pour une puberté précoce ou tardive, des mesures précises des œstrogènes guident les décisions de traitement qui peuvent affecter la croissance et le développement.

Pour les hommes âgés, les niveaux d'œstrogènes sont de plus en plus reconnus comme pertinents pour le risque de cancer de la prostate et la santé osseuse. Et pour les femmes ménopausées, une évaluation précise de l'exposition aux œstrogènes est cruciale pour évaluer le risque de cancer du sein et pour sélectionner des stratégies de prévention appropriées.

Les méthodes ultra-sensibles décrites dans cette revue — en particulier l'approche de dérivatisation NMPS nécessitant seulement 0,1 mL de sérum — permettent une mesure précise à des niveaux précédemment indétectables. Cela ouvre la voie à un meilleur suivi clinique et à une recherche plus fiable sur la façon dont les hormones affectent le risque de maladie tout au long de la vie. La capacité de mesurer 12 métabolites d'œstrogènes différents en une seule course de 45 minutes, à partir d'une seule goutte de sang, représente une amélioration spectaculaire par rapport aux jours où chaque œstrogène nécessitait un immunodosage séparé avec une exactitude discutable.

Limitations de l'approche actuelle

Malgré ces avancées, des limitations importantes subsistent. Premièrement, l'évaluation des effets de matrice est plus compliquée pour l'analyse des œstrogènes car une matrice blanche appropriée — un échantillon connu pour être complètement dépourvu d'œstrogènes — n'est pas facilement disponible. L'approche générale consiste à préparer des étalons d'étalonnage et des échantillons de contrôle qualité dans des matrices substitutives telles que le sérum dépouillé de charbon. Cependant, le processus de dépouillement au charbon peut éliminer des composants des échantillons réels qui causent des effets de matrice, ce qui signifie que les étalons d'étalonnage pourraient ne pas représenter pleinement les échantillons de patients réels.

Deuxièmement, les étalons internes marqués aux isotopes — malgré leur nom — peuvent ne pas toujours corriger parfaitement toutes les sources de variation, en particulier si les composés marqués au deutérium subissent un décalage du temps de rétention et une suppression d'ionisation différente des œstrogènes naturels.

Troisièmement, l'évaluation de l'efficacité de l'hydrolyse à travers les échantillons reste difficile en raison du manque d'étalons authentiques et d'étalons marqués aux isotopes stables pour toutes les formes conjuguées. La frustration liée à la mesure des conjugués intacts est aggravée par la disponibilité commerciale très limitée des étalons de référence nécessaires : une seule des cinq formes de sulfate d'E2 est actuellement disponible à l'achat.

Enfin, les préparations enzymatiques utilisées pour l'hydrolyse peuvent introduire des facteurs de confusion. L'enzyme couramment utilisée Helix pomatia est contaminée par une activité 3β-HSD, qui pourrait interférer si des androgènes sont mesurés dans le même échantillon. Et certains métabolites d'œstrogènes non conjugués en circulation ont des concentrations inférieures à la LLOQ de même ces méthodes avancées.

Recommandations pour les chercheurs et les cliniciens

Sur la base de leur vaste expérience, les auteurs offrent les recommandations pratiques suivantes pour quiconque effectue une analyse des œstrogènes à ultra-haute sensibilité :

1. Tester tous les fournitures avant utilisation : Les tubes, les réactifs et les enzymes doivent être testés au préalable pour s'assurer qu'ils n'introduiront pas de contamination ou d'interférence. La découverte des auteurs selon laquelle les tubes en verre pourraient contribuer à un signal semblable à celui des œstrogènes équivalent à 10 pg/mL est un avertissement.
2. Utiliser le MTBE pour l'extraction liquide-liquide : Il a démontré la récupération la plus complète des hormones stéroïdiennes testées par rapport à l'éther diéthylique, l'hexane et le 2-méthylbutane.
3. Choisissez des réactifs de dérivatisation pré-ionisés : Les dérivés NMPS fournissent des charges permanentes qui offrent la sensibilité la plus élevée (1,0 fg sur colonne) tout en dérivatisant au niveau du groupe hydroxyle phénolique, ce qui rend la méthode applicable à tous les œstrogènes.
4. Optimisez la séparation chromatographique avec des colonnes à particules de sous-2 μm : Ces colonnes offrent la résolution nécessaire pour séparer les catéchols isomères et les œstrogènes méthoxylés qui causeraient sinon des erreurs de surestimation.
5. Privilégiez les étalons internes marqués au ¹³C : Ils co-éluent exactement avec les analytes cibles dans toutes les conditions chromatographiques, éliminant ainsi les problèmes de décalage du temps de rétention associés aux labels deutérés.
6. Envisagez l'analyse des conjugués intacts : Cela évite entièrement les problèmes d'hydrolyse, bien que cela soit actuellement limité par la disponibilité des étalons de conjugués.
7. Réalisez une validation approfondie de la méthode : Confirmez la sensibilité, la spécificité et la reproductibilité du dosage avant d'analyser les échantillons cliniques, en suivant les directives de la FDA avec des critères d'acceptation d'une déviation de ±15 % et d'un CV inférieur à 15 %.
8. Soyez conscient des limites des matrices simulées : Le sérum dépouillé par charbon actif peut ne pas imiter pleinement les échantillons réels des patients, il convient donc d'interpréter les résultats avec la prudence appropriée.

Ces recommandations sont particulièrement pertinentes pour les laboratoires cliniques et les groupes de recherche travaillant avec des échantillons provenant d'hommes âgés, d'enfants, de femmes ménopausées et de femmes sous inhibiteurs de l'aromatase — des populations où une mesure précise et ultra-sensible des œstrogènes peut avoir un impact direct sur le diagnostic, les décisions thérapeutiques et les résultats pour les patients.

Questions fréquemment posées

Pourquoi est-il si difficile de mesurer les œstrogènes chez les personnes ayant des niveaux très faibles ?

Dans des groupes tels que les femmes ménopausées, les hommes âgés et les enfants, les niveaux d'œstrogènes peuvent être inférieurs à 5 picogrammes par millilitre, souvent 100 fois moins élevés que chez les adultes. De telles quantités infimes sont difficiles à détecter car les molécules d'œstrogène ne s'ionisent pas efficacement dans les instruments de laboratoire standards. Les chimistes utilisent des modifications chimiques spéciales et une spectrométrie de masse extrêmement sensible pour les mesurer avec précision.

Quels étaient les principaux problèmes des anciens tests d'œstrogènes (immunodosages) ?

Les anciens tests utilisant des anticorps réagissaient souvent de manière croisée avec des molécules similaires, donnant des lectures inexactes. Les résultats variaient entre les laboratoires, et chaque test ne pouvait mesurer qu'un seul œstrogène à la fois. La mesure de plusieurs produits de dégradation des œstrogènes nécessitait de nombreux tests séparés, rendant le processus lent et peu fiable pour les niveaux faibles.

Quelle est la précision des méthodes modernes de spectrométrie de masse pour les tests d'œstrogènes ?

Les techniques modernes utilisant la dilution par isotopes stables et la chromatographie liquide-spectrométrie de masse sont largement considérées comme l'étalon-or. Elles offrent une meilleure spécificité, une grande précision et peuvent mesurer plusieurs œstrogènes simultanément. En ajoutant une quantité connue d'œstrogène marqué, les scientifiques comparent les signaux pour calculer les niveaux naturels exacts, corrigeant ainsi de nombreuses erreurs des méthodes plus anciennes.

Que signifie un test d'œstrogènes ultra-sensible pour une femme prenant des inhibiteurs de l'aromatase ?

Pour les femmes ménopausées atteintes d'un cancer du sein sous inhibiteurs de l'aromatase, la connaissance précise des niveaux réels d'œstrogènes aide les oncologues à déterminer si le médicament est efficace. Les anciens tests pouvaient manquer des niveaux très faibles. Le test ultra-sensible peut mesurer les œstrogènes à partir d'une seule goutte de sang, offrant un suivi plus fiable de l'efficacité du traitement.

Pourquoi une mesure précise des œstrogènes est-elle importante pour les enfants présentant des préoccupations liées à la puberté ?

Chez les enfants évalués pour une puberté précoce ou tardive, les niveaux d'œstrogènes guident les décisions de traitement qui peuvent affecter la croissance et le développement. Les niveaux d'œstrogènes chez les enfants peuvent être environ 100 fois inférieurs aux niveaux adultes, ce qui les rend difficiles à mesurer. Les méthodes avancées permettent désormais une mesure précise à partir de très petits échantillons de sang, aidant les médecins à fournir des soins appropriés.

Quelle quantité de sang est nécessaire pour un test d'œstrogènes ultra-sensible ?

Certaines méthodes avancées nécessitent aussi peu que 0,1 millilitre de sérum, soit environ une seule goutte de sang. Par exemple, une méthode utilisant la dérivatisation au N-méthyl pyridinium-3-sulfonyl a atteint une haute sensibilité avec seulement 0,1 mL. Une méthode antérieure nécessitait 0,5 mL. Des exigences d'échantillon plus petites rendent le test plus facile pour les enfants et les patients fragiles.

Quels sont les avantages des nouveaux tests d'œstrogènes par rapport aux anciens tests ?

Les nouveaux tests peuvent mesurer jusqu'à 12 métabolites des œstrogènes différents en une seule analyse de 45 minutes à partir d'une seule goutte de sang. Ils offrent une bien meilleure précision aux niveaux très faibles, évitent les problèmes de réactivité croisée et fournissent des résultats fiables pour guider le traitement de conditions telles que le cancer du sein, les troubles de la puberté et le risque de cancer de la prostate. Cela améliore le suivi clinique et la recherche.

Devrais-je obtenir un deuxième avis sur mes résultats de test d'œstrogènes si je suis une femme ménopausée ou un homme âgé avec des niveaux d'œstrogènes très faibles ?

Oui, un deuxième avis peut être précieux car les anciens tests par immunodosages donnaient souvent des lectures inexactes en raison de la réactivité croisée, et les résultats variaient d'un laboratoire à l'autre. Les méthodes modernes de spectrométrie de masse sont la référence et peuvent mesurer avec précision les niveaux très faibles d'œstrogènes, inférieurs à 5 pg/mL, à partir d'une seule goutte de sang. Si votre test a été réalisé avec une ancienne méthode, un deuxième avis utilisant des techniques avancées peut fournir des résultats plus fiables, ce qui est important pour le suivi de la thérapie par inhibiteurs de l'aromatase ou l'évaluation du risque de cancer. Diagnostic Detectives Network fournit des deuxièmes avis d'experts indépendants.

Informations sur la source

Cet article à destination des patients est basé sur des recherches évaluées par les pairs publiées dans le Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology.

Original article title: Ultra-high sensitivity analysis of estrogens for special populations in serum and plasma by liquid chromatography-mass spectrometry

Authors: Qingqing Wang, Clementina Mesaros, and Ian A. Blair

Publication details: J Steroid Biochem Mol Biol. 2016 September; 162: 70–79. doi:10.1016/j.jsbmb.2016.01.002 (Published in final edited form as an HHS Public Access author manuscript, available in PMC 2017 September 01)

Affiliations: Center of Excellence in Environmental Toxicology and Penn SRP Center, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA; Department of Systems Pharmacology and Translational Therapeutics, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania; Department of Pharmacology and Toxicology, Beijing Institute of Radiation Medicine, Beijing, China.

Note : Cet article explique le contenu technique de la revue scientifique originale dans un langage adapté aux patients. Il est destiné à des fins éducatives et ne constitue pas un avis médical. Les patients ayant des questions sur les tests d'œstrogènes ou les conditions liées aux hormones devraient consulter leur fournisseur de soins de santé.