Ultra-hohe Sensitivität in der Östrogenmessung: Ein Leitfaden für die genaue Messung bei speziellen Bevölkerungsgruppen mit niedrigen Hormonspiegeln

Inhaltsverzeichnis

• Wichtige Punkte
• Warum die Östrogenmessung wichtig ist
• Wie Östrogene im Körper verarbeitet werden
• Die besondere Herausforderung: Bevölkerungsgruppen mit sehr niedrigem Östrogen
• Die Goldstandard-Methode: Flüssigkeitschromatographie–Massenspektrometrie
• Probenvorbereitung: Vorbereitung auf die Analyse
• Derivatisierung: Steigerung der Sensitivität durch Chemie
• Chromatographische Trennung: Unterscheidung ähnlicher Moleküle
• Matrixeffekte: Das versteckte Störungsproblem
• Klinische Implikationen: Was bedeutet dies für Patienten?
• Einschränkungen des aktuellen Ansatzes
• Empfehlungen für Forscher und Kliniker
• Häufig gestellte Fragen
• Quelleninformationen

Wichtige Punkte

• Ältere Östrogen-Immunoassays lieferten aufgrund von Kreuzreaktivität mit ähnlichen Molekülen oft ungenaue Werte.
• Die moderne stabile Isotopenverdünnung in Kombination mit Flüssigkeitschromatographie–Massenspektrometrie ist der Goldstandard für die Östrogenmessung.
• Bei postmenopausalen Frauen und älteren Männern liegen die Östrogenspiegel oft unter 5 pg/mL, was ultra-sensitive Methoden erfordert.
• Eine Methode unter Verwendung der NMPS-Derivatisierung benötigt nur 0,1 mL Serum und kann fünf verschiedene Östrogene mit hoher Sensitivität messen.
• Kontaminationen durch Laborutensilien, wie Glasröhrchen, können die Östrogenwerte fälschlich erhöhen und müssen überprüft werden.

Warum die Messung von Östrogen wichtig ist

Die Messung von Östrogen ist ein Grundpfeiler der modernen Endokrinologie. Sie spielt eine entscheidende Rolle bei der klinischen Bewertung vieler endokriner (hormonbezogener) Erkrankungen sowie in der Forschung, die untersucht, wie Hormone die menschliche Biologie und Krankheiten beeinflussen. Fast 30 Jahre lang stützten sich Wissenschaftler und Kliniker auf konventionelle Radioimmunoassays (RIAs) oder direkte Enzym-Immunoassays, um die zirkulierenden Östrogenspiegel zu messen.

Diese älteren Methoden boten eine gute Sensitivität, hatten jedoch einen schwerwiegenden Nachteil: einen Mangel an Spezifität. Die in Immunoassays verwendeten Antikörper kreuzreagieren häufig mit anderen Steroiden – Molekülen, die chemisch den Östrogenen ähneln –, was zu ungenauen Messwerten führt. Diese Kreuzreaktivität hat bei der Interpretation von Daten aus epidemiologischen Studien zu erheblichen Problemen geführt, und die Ergebnisse variierten häufig von Labor zu Labor.

Eine weitere große Einschränkung immunoassay-basierter Methoden besteht darin, dass sie nur ein Analyt gleichzeitig messen können. Um alle Metaboliten (Abbauprodukte) eines einzelnen Östrogens zu messen, müssen Forscher mehrere separate Assays durchführen, was zeitaufwändig und ineffizient ist. In den letzten Jahrzehnten haben jedoch erhebliche Fortschritte in einer Technik namens stabiler Isotopen-Verdünnung (SID) gekoppelt mit Flüssigkeitschromatographie–selektive Reaktionsüberwachung–Massenspektrometrie (LC-SRM/MS) eine leistungsstarke Lösung für diese Probleme geboten.

Doch selbst mit dieser fortschrittlichen Technologie bleibt eine Herausforderung enorm: die Quantifizierung von Östrogenen und ihren Metaboliten in Serum- und Plasmaproben von Populationen mit extrem niedrigen Östrogenspiegeln. Dazu gehören ältere Männer, Kinder, postmenopausale Frauen und Frauen, die Aromatasehemmer zur Behandlung von Brustkrebs erhalten. Dieser Review, verfasst von Forschern der Perelman School of Medicine der University of Pennsylvania und des Beijing Institute of Radiation Medicine, untersucht die besonderen Aspekte bei der Nutzung der ultra-hochsensitiven SID LC-SRM/MS-Methodik für diese anspruchsvollen Proben und schlägt Best Practices in jedem Schritt des analytischen Prozesses vor.

Wie Östrogene im Körper verarbeitet werden

Das Verständnis dafür, wie Östrogene im Körper wirken, hilft zu erklären, warum ihre Messung so wichtig ist. Zahlreiche klinische und experimentelle Studien haben gezeigt, dass relativ hohe Östrogenspiegel im Blut von Frauen mit einem erhöhten Risiko für Brustkrebs, Endometriumkarzinom und Eierstockkrebs verbunden sind – wobei bemerkenswert ist, dass viele dieser Studien RIA-Assays fragwürdiger Validität verwendeten. Bei Männern sind erhöhte zirkulierende Östrogene ebenfalls ein potenzieller Risikofaktor für Prostatakrebs.

Die Fähigkeit, Estradiol (E2) und Testosteron (T) bei Kindern genau zu messen, hat sich als entscheidend für die Diagnose und Behandlung von Störungen der Pubertät und der sexuellen Entwicklung erwiesen. Einige Studien haben auch gezeigt, dass höhere Östrogenspiegel in früheren Lebensjahren mit dem Beginn der Brustentwicklung bei Mädchen korrelieren, was darauf hindeutet, dass Hormone während der Entwicklungsphase das Krankheitsrisiko im späteren Leben modulieren könnten.

Östrogene wirken über zwei Hauptwege: Östrogenrezeptor (ER)-abhängige Mechanismen und ER-unabhängige Mechanismen. Der ER-abhängige Weg beinhaltet die direkte Stimulation der abnormalen Zellproliferation, die kausal mit der Entwicklung von Brustkrebs verbunden ist. Die ER-unabhängigen karzinogenen (krebserzeugenden) Effekte entstehen vermutlich durch die Wirkung genotoxischer – also DNA-schädigender – Östrogenmetaboliten.

So funktioniert dieser Prozess:

1. Elterliche Östogene unterliegen einem oxidativen Metabolismus (chemische Modifikation durch Enzyme) über die Cytochrom P450 (CYP)-Enzyme 1B1 und CYP3A4.
2. Dieser Prozess bildet zwei Arten von Catechol-Östrogenmetaboliten (eine chemische Struktur mit zwei benachbarten Hydroxylgruppen): 2,3-Catechole (2-OH-E1 und 2-OH-E2) und 3,4-Catechole (4-OH-E1 und 4-OH-E2).
3. CYP1B1 zeigt eine beträchtliche Regioselektivität – eine Präferenz von 9:1 – für die Bildung von 4-OH-E1 und 4-OH-E2 im Vergleich zu den 2-hydroxylierten Formen.
4. Forschungsergebnisse deuten darauf hin, dass 4-OH-E1 und 4-OH-E2 genotoxischer (DNA-schädigender) sind als die entsprechenden 2-OH-E1- und 2-OH-E2-Metaboliten.

Interessanterweise sind nicht alle Östrogenmetaboliten schädlich. 2-OH-E2 ist ein potenter Inhibitor von Aromatase (einem Enzym, das Androgene in Östrogene umwandelt), und 2-OH-E1 ist mit einem verringerten Risiko für östrogenrezeptor-positive (ER+) Brustkrebs bei postmenopausalen Frauen verbunden, nach Anpassung an die zirkulierenden Estron-(E1)-Konzentrationen. Beide Catechole werden schnell durch ein Enzym namens Catechol-O-Methyl-Transferase (COMT) in Methoxy-(OMe)-Metaboliten umgewandelt. Bemerkenswerterweise hat 2-OMe-E2 eine signifikante antiproliferative Aktivität, was bedeutet, dass es dazu beiträgt, ein unkontrolliertes Wachstum von Zellen zu verhindern.

Östrogene und ihre hydroxylierten Metaboliten werden auch leicht durch die Zugabe von Glucuronid-, Sulfat- oder Glutathion-(GSH)-Gruppen modifiziert, wodurch konjugierte Östrogenmetaboliten entstehen. Die häufigsten zirkulierenden Östrogenkonjugate sind Sulfate, die durch die Wirkung von Steroidsulfatasen als Östrogen-Vorstufen im Brustgewebe dienen können. Zirkulierende Androgene können bei postmenopausalen Frauen ebenfalls als Östrogen-Vorstufen durch die Wirkung von Aromatase dienen – was eine grundlegend andere Quelle für Östrogene im Vergleich zu prämenopausalen Frauen darstellt.

Aufgrund dieser vielfältigen Effekte und Stoffwechselwege sind Östrogene und ihre Metaboliten im Blutkreislauf wertvolle Biomarker – biologische Indikatoren – für die Biosynthese und den Metabolismus von Gewebe-Östrogenen.

Die besondere Herausforderung: Populationen mit sehr niedrigem Östrogenspiegel

Bei den meisten Erwachsenen in ihren reproduktiven Jahren sind die Östrogenspiegel hoch genug, um mit Standardmethoden gemessen zu werden. Bei bestimmten Gruppen stellt jedoch ein erhebliches analytisches Problem dar, dass ihre Östrogenspiegel außergewöhnlich niedrig sind.

Die typischen Serumkonzentrationen von unconjugiertem E2 bei postmenopausalen Frauen und älteren Männern liegen oft unter 5 pg/mL (Picogramm pro Milliliter — ein Picogramm ist ein Billionstel eines Gramms). Zum Vergleich: Die Werte für unconjugiertes E1 in diesen Gruppen reichen von 11,8 bis 37,4 pg/mL. In klinischen Studien der pädiatrischen Endokrinologie wurden die E2-Spiegel bei Kindern mit etwa 100-mal niedrigeren Werten als bei Erwachsenen berichtet, wobei die niedrigsten Werte in der präpubertären Phase (vor der Pubertät) auftreten.

Diese extrem niedrigen pg/mL-Werte stellen für die meisten auf LC-MS basierenden Assays eine enorme Herausforderung dar. Erschwerend kommt hinzu, dass andere unconjugierte Östrogenmetaboliten — wie Methoxy-Östrogene (MeO-Östrogene) oder Catechole — in noch geringeren Konzentrationen vorliegen, die in der Regel unterhalb der unteren Bestimmungsgrenze (LLOQ, die kleinste Menge, die zuverlässig gemessen werden kann) der meisten Standard-LC-MS-Assays liegen.

Die Herausforderung bezüglich der Empfindlichkeit resultiert hauptsächlich aus der schlechten Ionisierungseffizienz von unconjugierten Östrogenen und ihren Metaboliten — das bedeutet, dass sie die elektrische Ladung, die für den Nachweis durch Massenspektrometrie erforderlich ist, nur schwer aufnehmen. Aus diesem Grund haben Wissenschaftler zahlreiche Derivatisierungsstrategien (chemische Modifikationen) entwickelt, um die Ionisierung zu verbessern und die Empfindlichkeit zu erhöhen. Diese Strategien tragen oft auch zur Probenaufreinigung bei.

Es ist tatsächlich einfacher, gesamt Östrogene (unconjugierte plus conjugierte Formen) nach Hydrolyse oder Solvolyse (chemischer Abbau unter Verwendung von Wasser oder Alkohol) zu messen, da die Gesamtöstrogenspiegel mindestens 2–3-mal höher sind als die Spiegel unconjugierter Östrogene. Die Bewertung der Effizienz und Gleichmäßigkeit der Hydrolyse über verschiedene Proben hinweg bleibt jedoch problematisch und kann zu fehlerhaften Ergebnissen führen, da authentische Standards und stabile Isotopenstandards nicht immer für alle Östrogenkonjugate verfügbar sind.

Die Goldstandard-Methode: Flüssigkeitschromatographie–Massenspektrometrie

Die Methode der stabilen Isotopenverdünnung (SID) in Kombination mit Flüssigkeitschromatographie–selektiver Reaktionsüberwachung–Massenspektrometrie (LC-SRM/MS) wird heute weithin als „Goldstandard“ zur Quantifizierung von Östrogenen und ihren Metaboliten in Serum und Plasma anerkannt. Im Vergleich zu Immunoassays bietet dieser Ansatz eine verbesserte Spezifität, hohe Genauigkeit und die Möglichkeit, mehrere Östrogene gleichzeitig zu überwachen.

Das Prinzip funktioniert wie folgt: Den Patientenproben wird eine bekannte Menge einer „schweren“ (isotopenmarkierten) Version jedes Östrogens zugesetzt. Da die markierte und die unmarkierte Version während der Extraktion und Analyse identisch reagieren, können Forscher die genaue Menge des natürlichen Östrogens berechnen, indem sie die beiden Signale vergleichen. Dieser selbstkorrigierende Ansatz beseitigt viele Fehlerquellen, die ältere Methoden belasten.

Eine ultra-hohe Empfindlichkeit kann erreicht werden, wenn Östrogenmoleküle in „präionisierte“ Derivate (chemisch modifizierte Formen, die bereits eine Ladung tragen) umgewandelt und mit Dreivierfach-Quadrupol-Massenspektrometern im Modus der selektiven Reaktionsüberwachung (SRM) analysiert werden, gekoppelt mit Nanofluss-Flüssigkeitschromatographie (eine Technik, die extrem niedrige Flussraten verwendet).

Zwei wegweisende Methoden demonstrieren die Kraft dieses Ansatzes:

• 2011 — Girard P (GP) Derivat-Methode: Wird zur Analyse von E1 und seinen Metaboliten verwendet. Ermöglichte Forschern, nur 0,5 mL Serum zu verwenden. Die untere Bestimmungsgrenze für jedes Östrogen lag bei 0,156 pg/mL (15,6 Femtogramm [fg] auf der Säule) — ein Femtogramm ist ein Billiardstel eines Gramms.
• 2015 — N-Methylpyridinium-3-sulfonyl (NMPS) Derivat-Methode: Wird für E2 und seine Metaboliten verwendet. Erforderte lediglich 0,1 mL Serum — ein einziger Tropfen — und erreichte dennoch eine erstaunliche Sensitivität von 1,0 fg auf der Säule für fünf Östrogene und ihre Metaboliten.

Probenvorbereitung: Vorbereitung auf die Analyse

Bevor eine Östrogenmessung erfolgen kann, muss die Probe vorbereitet werden. Dies umfasst typischerweise die Extraktion (Trennung der Östrogene von anderen Blutbestandteilen), die Aufreinigung und die Konzentrierung. Es gibt zwei Hauptansätze für den Umgang mit conjugierten Östrogenen: Sie können vor der Analyse durch Hydrolyse in unconjugierte Formen umgewandelt werden, oder sie können als intakte Konjugate gemessen werden.

Die Hydrolyse wandelt Konjugate in unconjugierte Formen um, was deren Konzentration in der Probe erhöht. Nach der Hydrolyse können Östrogene aus Serum und Plasma effizient durch Flüssig-Flüssig-Extraktion (LLE) oder Festphasenextraktion (SPE) extrahiert werden.

Flüssig-Flüssig-Extraktion (LLE): LLE ist kostengünstig, schnell und oft die primäre Extraktionsmethode für die Östrogenanalyse. Ihre Nachteile sind der hohe Arbeitsaufwand, der Zeitaufwand und die im Vergleich zur SPE schwierigere Automatisierbarkeit. Die am häufigsten verwendeten Lösungsmittel sind Methyl-tert-butylether (MTBE), Diethylether, Dichlormethan oder Mischungen organischer Lösungsmittel. MTBE kann sowohl unconjugierte Östrogene aus Serum als auch Östrogen-Derivate aus dem Derivatisierungspuffer extrahieren.

Eine gründliche Untersuchung von Keski-Rahkonen und Kollegen verglich die Extraktionseffizienz von MTBE, Diethylether, Hexan und 2-Methylbutan aus Serumproben. Die Studie zeigte, dass LLE mit MTBE die getesteten Steroidhormone vollständig zurückgewann, im Gegensatz zu den anderen Lösungsmitteln, was es zur bevorzugten Wahl macht.

Festphasenextraktion (SPE): Die offline oder online gekoppelte SPE mit LC-MS ist eine vielversprechende Technik für die semi-automatisierte Probenanalyse. Die Vorteile der online-SPE umfassen eine kürzere Analysedauer, konzentriertere chromatographische Banden und ein erheblich reduziertes Kontaminationsrisiko.

Eine bemerkenswerte Studie von Zhao und Kollegen berichtete über eine LC-MS-Methode zur Bestimmung von 12 unconjugierten Östrogenen und ihren intakten Konjugaten in Blut und Urin. Diese Methode verwendete nur einen einzigen SPE-Schritt sowohl für unconjugierte Östrogene als auch für ihre Konjugate: Nach dem Aufbringen der Proben auf eine Oasis HLB (hydrophil-lipophilische Balance)-Patrone wurden die unconjugierten Östrogene zunächst mit Ethylacetat eluiert, und die Konjugate anschließend mit Methanol unter Zugabe von 0,1 % Ammoniumhydroxid.

Eine neuere Studie berichtete über einen automatisierten Online-Prozess zur Fallen- und Elutionsgewinnung unter Verwendung einer schwach kationenaustauschenden (WCX) Festphasenextraktionsfalle mit Online-Verdünnung. Dieser Ansatz zeigt Potenzial für die Anwendung bei Proben älterer Männer, Kinder und prämenopausale Frauen, da das optimierte Verfahren nur 100 μL Serum erfordert, eine untere Bestimmungsgrenze von 3 pg/mL erreicht und eine hervorragende Genauigkeit und Präzision bietet.

Zwei Ansätze für konjugierte Östrogene:

Der erste Ansatz beinhaltet die Hydrolyse von β-Glucuronid- und Sulfatkonjugaten vor der Extraktion und Derivatisierung. Das am häufigsten verwendete Enzym ist β-Glucuronidase/Arylsulfatase, die aus der Schnecke Helix pomatia gereinigt wurde. Dieses Enzym enthält natürlicherweise sowohl β-Glucuronidase- als auch Sulfatase-Aktivität in nahezu gleichen Anteilen. Im Gegensatz dazu enthält das Enzym aus E. coli nur β-Glucuronidase und ist im Wesentlichen frei von Sulfatase-Aktivität.

Forscher sollten jedoch vorsichtig sein: Es gibt Hinweise darauf, dass der Extrakt aus Helix pomatia mit 3β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase (HSD) oder Cholesterin-Oxidase-Aktivität kontaminiert ist. Dies könnte Studien verfälschen, bei denen die interessierenden Analyten Substrate der 3β-HSD sind — ein sehr wichtiges Problem, wenn Androgene in derselben Probe analysiert werden.

Experimente mit synthetisierten Estrogen-Sulfatkonjugaten offenbarten eine weitere kritische Einschränkung: Nur die 3-Sulfat-Form wird durch enzymatische Hydrolyse gespalten; die 17-Sulfatgruppe ist resistent. Ein vielversprechender Ansatz besteht in der Solvolyse der Konjugate unter Verwendung von wasserfreiem methanolischem Chlorwasserstoff — ein Verfahren, das erstmals 1989 von Tang und Crone veröffentlicht wurde und anschließend von mehreren Forschungsgruppen verwendet wurde. Überraschenderweise scheint diese Methode noch nicht auf Serum- und Plasmaproben älterer Männer, Kinder und prämenopausale Frauen angewandt worden zu sein.

Der zweite Ansatz beinhaltet die Analyse des intakten Konjugats mittels Massenspektrometrie im negativen Ionenmodus, ohne enzymatische Hydrolyse oder Derivatisierung. Jüngere Studien stellten fest, dass die gesamte E1-Konzentration bei prämenopausale Frauen zwischen 61,3 und 442,1 pg/mL liegt, einschließlich E1-Sulfat mit einer mittleren Konzentration von 244,8 pg/mL. Diese höheren Spiegel an E1-Glucuronid oder E1-Sulfat könnten relativ einfach durch LC-MS quantifiziert werden. E1-Sulfat im Serum kann effizient mit Oasis-HLB- oder schwach anionenaustauschenden (WAX)-Kartuschen extrahiert und mit Ammoniumacetat oder Ammoniumhydroxid eluiert werden.

Dieser Ansatz zur Analyse intakter Konjugate ist vielversprechend, steht jedoch vor einem erheblichen Hindernis: dem Fehlen authentischer Referenzstandards für Estrogen-Konjugate und schwerer stabiler Isotop-Analoga als interne Standards. Beispielsweise ist derzeit nur einer von fünf möglichen E2-Sulfaten (3-Sulfat, 17-Sulfat, 3-Sulfat-17-Glucuronid, 3-Glucuronid-17-Sulfat und 3,17-Bis-sulfat) kommerziell erhältlich: 17β-E2-2,4,6-[²H]₄-3-sulfate.

Derivatisierung: Steigerung der Empfindlichkeit durch Chemie

Da unkonjugierte Östrogene im Blut älterer Männer, Kinder und prämenopausale Frauen in extrem niedrigen Konzentrationen vorliegen, erfordert die zuverlässige Messung derzeit eine Derivatisierung — das Anhängen einer chemischen Gruppe an das Estrogenmolekül, um seine Nachweisfähigkeit zu verbessern. Für diesen Zweck wurden viele chemische Derivatisierungsreagenzien entwickelt, die auf die phenolische Hydroxylgruppe (eine reaktive -OH-Gruppe, die am aromatischen Ring gebunden ist) der Estrogenmoleküle abzielen.

Berichtete Derivatisierungsreagenzien umfassen:

• Pentafluorbenzyl (PFB)
• Pyridyl-3-sulfonyl (PS)
• Dansyl (D)
• 2-Picolinoyl (P)
• N-Methyl-2-pyridinyl (NMP)
• N-Methyl-nicotinoyl (NMN)
• 1-(2,4-Dinitro-5-fluorphenyl)-4,4-dimethylpiperazinyl (MPPZ)
• 3-Pentafluorbenzyl-17β-pyridinium (PFBPY)
• 1,2-Dimethylimidazol-5-sulfonylchlorid (DMIS)

Die meisten dieser Derivate (PFB, PNB, PS, D und P) tragen keine elektrische Ladung am Molekül, was ihre Fähigkeit begrenzt, Nachweisgrenzen im unteren pg/mL-Bereich zu erreichen. Darüber hinaus neigen diese Derivate aufgrund der chemischen Ähnlichkeit der Östrogene dazu, unspezifische Fragmentierungsmuster zu erzeugen, was zu einer schlechten analytischen Spezifität führt.

Die Derivate, die eine permanente Ladung tragen — MP, NMN, MPPZ, PFBPY und DMIS — sind viel besser geeignet, um eine Empfindlichkeit im pg/mL-Bereich zu erreichen. Die bisher leistungsfähigste Methode stammt jedoch aus dem eigenen Labor der Autoren: das NMPS-Derivat (N-Methylpyridinium-3-sulfonyl). Dieses vorionisierte Derivatisierungsverfahren wandelt E2 und seine Metaboliten in permanent geladene Moleküle um. Mit einer unteren Bestimmungsgrenze von 1,0 fg auf der Säule bei einem Injektionsvolumen von 1 μL ermöglicht es die absolute Quantifizierung unkonjugierter Östrogene in Serumproben von Frauen nach den Wechseljahren und älteren Männern. Da die Derivatisierung an der phenolischen Hydroxylgruppe stattfindet — einem Merkmal, das allen Östrogenen gemeinsam ist — kann diese Methode verallgemeinert werden, um alle Östrogene zu messen.

Bei jeder hochempfindlichen Analyse müssen Forscher äußerste Vorsicht walten lassen. Winzige Mengen an Kontamination, Carryover-Effekte von einer vorherigen Injektion oder Hintergrundstörungen durch Verarbeitungsutensilien können die Datenqualität beeinträchtigen. Es ist besonders wichtig, eine geeignete Blankomatrix (eine Probe ohne Östrogene) zu verwenden, um den Systemhintergrund aus Röhrchen, Extraktionslösungsmitteln, Derivatisierungspuffern und dem Instrument selbst zu überprüfen.

Dies ist kein theoretisches Problem. Während ihrer eigenen Arbeit stellten die Autoren unerwartet fest, dass einige Glasröhrchen eine Störung des E2-Signals verursachten, die etwa 10 pg/mL im Serum entsprach, während der enzymatischen Hydrolyse — eine Menge, die groß genug ist, um Ergebnisse in einer Population, in der die normalen E2-Spiegel unter 5 pg/mL liegen, vollständig ungültig zu machen.

Chromatographische Trennung: Ähnliche Moleküle unterscheiden

Bei der Östrogenquantifizierung auf Basis von LC-SRM/MS kann eine Störung durch isobare Verbindungen — Moleküle mit der gleichen Masse, die nicht das Zielöstrogen sind — ein kritisches Problem darstellen. Diese isobaren Störungen können aus exogenen Quellen (außerhalb des Körpers) oder aus endogenen Verbindungen (natürlich im Körper vorhanden), einschließlich anderer Steroide, stammen.

Leider neigen Östrogene und ihre Metaboliten dazu, ähnliche Produktionen zu bilden, wenn sie in der Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) fragmentiert werden. Wenn beispielsweise Dansyl-Derivate analysiert werden, wird die Produktion m/z 171 (ein spezifisches Masse-zu-Ladungs-Verhältnis) häufig als Quantifizierer oder Qualifizierer für alle Östrogene und ihre Metaboliten ausgewählt, da sie vom Dansyl-Gruppierung selbst stammt. Diese Universalität wird zu einem Problem: Wenn E1 und seine Metaboliten chromatographisch nicht von E2 und seinen Metaboliten getrennt werden, kann es zu einer Überschätzung von unkonjugiertem E2 kommen — insbesondere, da unkonjugiertes E1 in der Konzentration normalerweise 2–3 Mal höher ist als E2.

Noch herausfordernder ist die genaue Quantifizierung der einzelnen Isomere der Catechol-Östrogene — spezifisch 2- und 4-OH-E1, 2- und 4-OH-E2 sowie deren entsprechende Methoxy-Metaboliten — da diese Isomere in ihrer Struktur extrem ähnlich sind und chromatographisch voneinander getrennt werden müssen.

Forscher haben mehrere Strategien entwickelt, um dieses Problem anzugehen:

• Erhöhung der Peakkapazität (die Fähigkeit, viele Verbindungen in einem Lauf zu trennen)
• Optimierung der Gradientenelution (allmähliche Änderung der Lösungsmittelzusammensetzung im Laufe der Zeit)
• Verwendung kleinerer stationärer Phasenpartikel — zunehmend werden Partikel mit einer Größe unter 2 μm eingesetzt, um die chromatographische Kapazität, die Empfindlichkeit und die Geschwindigkeit der Analyse zu verbessern.

Als Beispiel: In einer jüngsten Studie der Autoren wurden 12 Östrogenmetaboliten erfolgreich auf einer Waters BEH130 C18-Säule (150 μm × 100 mm, 1,7 μm, 130 Å) innerhalb von 45 Minuten nach der Pyridiniumsulfonyl-Derivatisierung getrennt. Dazu gehörten vier Catechol-Östrogene (4-OHE1, 2-OHE1, 4-OHE2, 2-OHE2) und vier MeO-Östrogene (4-MeOE1, 2-MeOE1, 4-MeOE2, 2-MeOE2).

Matrixeffekte: Das verborgene Störungsproblem

Menschliches Serum und Plasma sind komplexe biologische Mischungen. Sie enthalten Komponenten wie Phospholipide und Salze, die die Ionisierungseffizienz von Östrogenen entweder verstärken oder unterdrücken können — das bedeutet, dass sie das Östrogensignal stärker oder schwächer machen können, als es sein sollte. Diese „Matrixeffekte“ wurden als potenzielles „Achillesferkel“ der LC-MS/MS-basierten Analyse biologischer Proben bezeichnet.

Bei einer besonders problematischen Beobachtung stießen Keski-Rahkonen und Kollegen auf Matrixeffekte, wenn LC-MS-basierte Assays in Teströhrchen oder Multikammerplatten aus Kunststoff durchgeführt wurden — ein gängiges Labormaterial, das unerwartete Variabilität einführen könnte.

Eine subtile Gefahr: Mitelutionierende Verbindungen (Substanzen, die zur gleichen Zeit wie das Zielöstrogen aus der Chromatographiesäule eluieren) sind in den überwachten Bereichen oder Übergängen nicht immer sichtbar. Dieses Phänomen ist als „Geisterpeaks“ bekannt — unsichtbare Störungen, die Ergebnisse still und unbemerkt verfälschen können.

Für die Östrogenanalyse ist die Elektrospray-Ionisation im positiven Modus (ESI) nach der Derivatisierung die am weitesten verbreitete Ionisierungsmethode. Es wurde jedoch argumentiert, dass ESI anfälliger für Ionensuppression ist als die chemische Ionisation bei atmosphärischem Druck (APCI). Interessanterweise zeigte die Forschung, dass unterivatisiertes E2 im negativen ESI-Modus mindestens eine 10-fache Steigerung der Empfindlichkeit gegenüber der photoionisation bei atmosphärischem Druck (APPI) im positiven Modus aufwies und nicht unter Störungen durch mitelutionierende isobare Verbindungen litt.

Es gibt drei allgemeine Strategien zur Bewertung von Matrixeffekten:

1. Post-Säulen-Infusion: Kontinuierliche Infusion des Analyten in den Massenspektrometer während der Injektion einer Blankomatrixprobe, um Signaländerungen zu beobachten.
2. Post-Extraktions-Zugabe: Zugabe einer bekannten Menge an Analyt zur extrahierten Blankomatrix und Vergleich mit einer reinen Lösung.
3. Vergleich der Steigungen der Kalibrierkurven: Vergleich der Steigung einer in Matrix hergestellten Kalibrierkurve mit einer in reiner Lösung hergestellten Kurve.

Gemäß den Richtlinien der FDA von 2013 sollten geeignete Maßnahmen ergriffen werden, um das Fehlen von Matrixeffekten während der gesamten Anwendung der Methode sicherzustellen, insbesondere wenn die für Produktionschargen verwendete Matrix von der bei der Methodenvalidierung verwendeten Matrix abweicht. Die Akzeptanzkriterien verlangen, dass der gemessene Wert innerhalb des Bereichs einer Abweichung von 15 % vom Nominalwert liegt, während die Variationskoeffizient (CV, ein Maß dafür, wie stark die Ergebnisse streuen) weniger als 15 % betragen sollte.

Mehrere Ansätze können Matrixeffekte bei der Estrogenquantifizierung reduzieren:

• Verbesserung des Probenvorbereitungsverfahrens
• Optimierung der chromatographischen Trennung
• Einsatz stabiler, isotopenmarkierter interner Standards

Auch interne Standards erfordern eine sorgfältige Betrachtung. Forscher sollten bei der Verwendung von [²H]-analogen internen Standards (deuteriummarkiert) Vorsicht walten lassen, da eine Verschiebung der Retentionszeit zwischen nicht markierten und deuteriummarkierten Verbindungen analytisch bedeutsam sein kann — was zu einer unterschiedlichen Unterdrückung der Signale des Analyten und des internen Standards führen kann. Idealerweise sollten [¹³C]-haltige Analoga (carbon-13-markiert) der Zielanalyten als interne Standards verwendet werden, da sie unter allen chromatographischen Bedingungen exakt koeleuieren. Sie beseitigen auch die Möglichkeit eines Deuteriumaustauschs in protischen (wasserhaltigen) Lösungsmitteln. Durch die verbesserte chromatographische Auflösung, die durch Partikel mit einer Größe von unter 2 μm ermöglicht wird, kann es zu einer größeren Trennung zwischen Analyten und ihren entsprechenden Deuteriumanalogon kommen, was die Wirksamkeit des internen Standards weiter verringert.

Klinische Implikationen: Was bedeutet dies für Patienten?

Diese technischen Fortschritte sind nicht nur akademische Übungen — sie haben direkte Auswirkungen auf die Patientenversorgung. Für postmenopausale Frauen, die Aromatasehemmer zur Behandlung von Brustkrebs einnehmen, hilft die Kenntnis ihrer tatsächlichen Estrogenspiegel Onkologen dabei zu bestimmen, ob das Arzneimittel wirksam ist. Bei Kindern, die auf frühe oder verzögerte Pubertät untersucht werden, leiten genaue Estrogenmessungen Behandlungsentscheidungen ein, die Wachstum und Entwicklung beeinflussen können.

Bei älteren Männern werden Estrogenspiegel zunehmend als relevant für das Prostatakrebsrisiko und die Knochengesundheit anerkannt. Und bei postmenopausalen Frauen ist eine genaue Beurteilung der Estrogenexposition entscheidend für die Bewertung des Brustkrebsrisikos und für die Auswahl geeigneter Präventionsstrategien.

Die in diesem Überblick beschriebenen hochempfindlichen Methoden — insbesondere der NMPS-Derivatisierungsansatz, der nur 0,1 mL Serum erfordert — ermöglichen eine genaue Messung bei Konzentrationen, die zuvor nicht nachweisbar waren. Dies eröffnet die Tür zu einem besseren klinischen Monitoring und einer zuverlässigeren Forschung darüber, wie Hormone das Krankheitsrisiko im Laufe des Lebens beeinflussen. Die Fähigkeit, 12 verschiedene Estrogenmetabolite in einem einzelnen 45-minütigen Lauf aus einem einzigen Blutstropfen zu messen, stellt eine dramatische Verbesserung gegenüber den Zeiten dar, in denen für jedes Estrogen ein separater Immunoassay mit fragwürdiger Genauigkeit erforderlich war.

Einschränkungen des aktuellen Ansatzes

Trotz dieser Fortschritte bleiben erhebliche Einschränkungen bestehen. Erstens ist die Bewertung von Matrixeffekten bei der Estrogenanalyse komplizierter, da eine geeignete Blankomatrix — eine Probe, die vollständig frei von Estrogenen ist — nicht leicht verfügbar ist. Der allgemeine Ansatz besteht darin, Kalibrierstandards und Qualitätskontrollproben in Surrogatmatrices wie charcoalentzogenem Serum herzustellen. Der Prozess der Entkohlung (charcoal stripping) kann jedoch Komponenten echter Proben entfernen, die Matrixeffekte verursachen, sodass Kalibrierstandards reale Patientenproben möglicherweise nicht vollständig abbilden.

Zweitens können isotopenmarkierte interne Standards — trotz ihres Namens — nicht immer alle Quellen der Variation perfekt korrigieren, insbesondere wenn deuteriummarkierte Verbindungen in ihrer Retentionszeit verschoben sind und einer anderen Ionisationsunterdrückung unterliegen als die natürlichen Estrogene.

Drittens bleibt die Bewertung der Hydrolysewirksamkeit über Proben hinweg aufgrund des Fehlens authentischer Standards und stabiler Isotopenstandards für alle konjugierten Formen schwierig. Die Frustration bei der Messung intakter Konjugate wird durch die sehr begrenzte kommerzielle Verfügbarkeit der erforderlichen Referenzstandards noch verstärkt: Nur eine der fünf E2-Sulfat-Formen ist derzeit käuflich erhältlich.

Schließlich können die für die Hydrolyse verwendeten Enzympräparationen Störfaktoren einführen. Das häufig verwendete Enzym Helix pomatia ist mit 3β-HSD-Aktivität kontaminiert, was stören könnte, wenn in derselben Probe auch Androgene gemessen werden. Und einige unkonjugierte Estrogenmetabolite im Kreislauf haben Konzentrationen unterhalb der LLOQ (untere Bestimmungsgrenze) selbst dieser fortschrittlichen Methoden.

Empfehlungen für Forscher und Kliniker

Basierend auf ihrer umfangreichen Erfahrung bieten die Autoren folgende praktische Empfehlungen für alle an, die hochempfindliche Estrogenanalysen durchführen:

1. Alle Versorgungsartikel vorab testen: Röhrchen, Reagenzien und Enzyme sollten vorab getestet werden, um sicherzustellen, dass sie keine Kontamination oder Interferenz verursachen. Die eigene Entdeckung der Autoren, dass Glasröhrchen ein Estrogen-ähnliches Signal äquivalent zu 10 pg/mL beitragen könnten, ist eine warnende Geschichte.
2. MTBE für die Flüssig-Flüssig-Extraktion verwenden: Es zeigte im Vergleich zu Diethylether, Hexan und 2-Methylbutan die vollständigste Rückgewinnung der getesteten Steroidhormone.
3. Wählen Sie vorionisierte Derivatisierungsreagenzien: NMPS-Derivate bieten permanente Ladungen, die die höchste Empfindlichkeit (1,0 fg auf der Säule) erreichen und am phenolischen Hydroxylgruppe derivatisieren, wodurch die Methode für alle Östrogene anwendbar ist.
4. Optimieren Sie die chromatographische Trennung mit Säulen aus Partikeln unter 2 μm: Diese bieten die benötigte Auflösung, um isomere Catechine und Methoxy-Östrogene zu trennen, die andernfalls zu Fehlbewertungen führen würden.
5. Bevorzugen Sie ¹³C-markierte interne Standards: Diese eluieren unter allen chromatographischen Bedingungen exakt mit den Zielanalyten und beseitigen Probleme durch Retentionszeitverschiebungen, die mit Deuteriummarkierungen verbunden sind.
6. Berücksichtigen Sie die Analyse intakter Konjugate: Dies vermeidet Hydrolyseprobleme vollständig, ist jedoch derzeit durch die Verfügbarkeit von Konjugat-Standards begrenzt.
7. Führen Sie eine gründliche Methodenvalidierung durch: Bestätigen Sie die Empfindlichkeit, Spezifität und Reproduzierbarkeit des Assays vor der Analyse klinischer Proben, folgen Sie den FDA-Richtlinien mit Akzeptanzkriterien von ±15 % Bias und einer CV unter 15 %.
8. Seien Sie sich der Einschränkungen von Surrogatmatrices bewusst: Mit Aktivkohle behandeltes Serum kann echte Patientenproben möglicherweise nicht vollständig nachahmen, daher sollten die Ergebnisse mit angemessener Vorsicht interpretiert werden.

Diese Empfehlungen sind insbesondere für klinische Labore und Forschungsgruppen relevant, die mit Proben von älteren Männern, Kindern, postmenopausalen Frauen und Frauen unter Aromatasehemmern arbeiten — Populationen, bei denen eine genaue, ultrasensitive Östrogenmessung Diagnose, Behandlungsentscheidungen und Patientenergebnisse direkt beeinflussen kann.

Häufig gestellte Fragen

Warum ist es so schwierig, Östrogen bei Menschen mit sehr niedrigen Spiegeln zu messen?

Bei Gruppen wie postmenopausalen Frauen, älteren Männern und Kindern können die Östrogenspiegel unter 5 Picogramm pro Milliliter liegen, oft 100-mal niedriger als bei Erwachsenen. Solch winzige Mengen sind schwer zu detektieren, da Östrogenmoleküle in Standard-Laborgeräten nicht effizient ionisieren. Chemiker verwenden spezielle chemische Modifikationen und extrem empfindliche Massenspektrometrie, um sie genau zu messen.

Was waren die Hauptprobleme bei älteren Östrogen-Tests (Immunoassays)?

Ältere Tests mit Antikörpern kreuzreaktierten häufig mit ähnlichen Molekülen, was zu ungenauen Werten führte. Die Ergebnisse variierten zwischen den Laboren, und jeder Test konnte nur ein Östrogen gleichzeitig messen. Die Messung mehrerer Östrogen-Abbauprodukte erforderte viele separate Tests, was den Prozess bei niedrigen Spiegeln langsam und unzuverlässig machte.

Wie genau sind moderne Massenspektrometrie-Methoden für Östrogen-Tests?

Moderne Techniken unter Verwendung stabiler Isotopenverdünnung und Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie gelten weithin als Goldstandard. Sie bieten eine bessere Spezifität, hohe Genauigkeit und können mehrere Östrogene gleichzeitig messen. Durch Zugabe einer bekannten Menge markierten Östrgens vergleichen Wissenschaftler die Signale, um die exakten natürlichen Spiegel zu berechnen, wodurch viele Fehler älterer Methoden korrigiert werden.

Was bedeutet ein ultrasensitiver Östrogen-Test für eine Frau, die Aromatasehemmer einnimmt?

Für postmenopausale Frauen mit Brustkrebs unter Aromatasehemmern hilft die genaue Kenntnis der tatsächlichen Östrogenspiegel Onkologen zu erkennen, ob das Medikament wirkt. Ältere Tests könnten sehr niedrige Spiegel übersehen haben. Ultrasensitive Tests können Östrogen aus einem einzelnen Blutstropfen messen und bieten eine zuverlässigere Überwachung der Behandlungswirksamkeit.

Warum ist eine genaue Östrogenmessung für Kinder mit Pubertätsbedenken wichtig?

Bei Kindern, die auf frühe oder verzögerte Pubertät untersucht werden, leiten die Östrogenspiegel Behandlungsentscheidungen ab, die Wachstum und Entwicklung beeinflussen können. Die Östrogenspiegel bei Kindern können etwa 100-mal niedriger sein als bei Erwachsenen, was sie schwer messbar macht. Fortschrittliche Methoden ermöglichen nun eine genaue Messung aus sehr kleinen Blutproben und helfen Ärzten, eine angemessene Versorgung bereitzustellen.

Wie viel Blut wird für ultrasensitive Östrogen-Tests benötigt?

Einige fortschrittliche Methoden benötigen so wenig wie 0,1 Milliliter Serum, etwa ein einzelner Blutstropfen. Zum Beispiel erreichte eine Methode unter Verwendung von N-Methylpyridinium-3-sulfonyl-Derivatisierung hohe Empfindlichkeit mit nur 0,1 mL. Eine frühere Methode benötigte 0,5 mL. Kleinere Probenanforderungen machen die Tests für Kinder und gebrechliche Patienten einfacher.

Welche Vorteile bieten neuere Estrogen-Tests im Vergleich zu älteren Tests?

Neuere Tests können bis zu 12 verschiedene Estrogen-Metaboliten in einem einzigen 45-minütigen Durchlauf aus einem einzelnen Blutstropfen messen. Sie bieten eine deutlich bessere Genauigkeit bei sehr niedrigen Werten, vermeiden Probleme durch Kreuzreaktivität und liefern zuverlässige Ergebnisse zur Therapieunterstützung bei Erkrankungen wie Brustkrebs, Pubertätsstörungen und dem Risiko für Prostatakrebs. Dies verbessert die klinische Überwachung und die Forschung.

Sollte ich als postmenopausale Frau oder älterer Mann mit sehr niedrigen Estrogenwerten eine zweite Meinung zu meinen Estrogen-Testergebnissen einholen?

Ja, eine zweite Meinung kann wertvoll sein, da ältere Immunoassays aufgrund von Kreuzreaktivität oft ungenaue Werte lieferten und die Ergebnisse zwischen den Laboren variierten. Moderne Massenspektrometrie-Methoden sind der Goldstandard und können sehr niedrige Estrogenwerte unter 5 pg/mL mit einem einzelnen Blutstropfen genau messen. Wenn Ihr Test mit einer älteren Methode durchgeführt wurde, kann eine zweite Meinung mittels fortschrittlicher Techniken zuverlässigere Ergebnisse liefern, was wichtig ist für die Überwachung einer Aromatasehemmer-Therapie oder zur Einschätzung des Krebsrisikos. Diagnostic Detectives Network bietet unabhängige Experten-Zweitmeinungen an.

Quelleninformationen

Dieser patientenfreundliche Artikel basiert auf peer-reviewter Forschung aus dem Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology.

Original article title: Ultra-high sensitivity analysis of estrogens for special populations in serum and plasma by liquid chromatography-mass spectrometry

Authors: Qingqing Wang, Clementina Mesaros, and Ian A. Blair

Publication details: J Steroid Biochem Mol Biol. 2016 September; 162: 70–79. doi:10.1016/j.jsbmb.2016.01.002 (Published in final edited form as an HHS Public Access author manuscript, available in PMC 2017 September 01)

Affiliations: Center of Excellence in Environmental Toxicology and Penn SRP Center, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA; Department of Systems Pharmacology and Translational Therapeutics, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania; Department of Pharmacology and Toxicology, Beijing Institute of Radiation Medicine, Beijing, China.

Hinweis: Dieser Artikel erklärt den technischen Inhalt der ursprünglichen wissenschaftlichen Übersicht in patientenfreundlicher Sprache. Er dient ausschließlich Bildungszwecken und stellt keine medizinische Beratung dar. Patienten mit Fragen zu Estrogen-Tests oder hormonbedingten Erkrankungen sollten ihren Arzt konsultieren.