Lograr una sensibilidad ultraalta en el análisis de estrógenos: una guía para la medición precisa en poblaciones especiales con niveles hormonales bajos

Tabla de contenidos

• Puntos clave
• Por qué es importante la medición de estrógenos
• Cómo se procesan los estrógenos en el cuerpo
• El desafío especial: poblaciones con estrógenos muy bajos
• El método estándar de oro: cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas
• Preparación de la muestra: prepararse para el análisis
• Derivatización: aumentar la sensibilidad mediante la química
• Separación cromatográfica: distinguir moléculas similares
• Efectos de matriz: el problema oculto de la interferencia
• Implicaciones clínicas: qué significa esto para los pacientes
• Limitaciones del enfoque actual
• Recomendaciones para investigadores y médicos
• Preguntas frecuentes
• Información de la fuente

Puntos clave

• Los inmunoensayos de estrógenos más antiguos a menudo daban lecturas inexactas debido a la reactividad cruzada con moléculas similares.
• La dilución isotópica estable moderna con cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas es el estándar de oro para la medición de estrógenos.
• En mujeres posmenopáusicas y hombres mayores, los niveles de estrógenos suelen estar por debajo de 5 pg/mL, lo que requiere métodos ultrasensibles.
• Un método que utiliza derivatización con NMPS necesita solo 0,1 mL de suero y puede medir cinco estrógenos con alta sensibilidad.
• La contaminación procedente de materiales de laboratorio, como los tubos de vidrio, puede elevar falsamente los resultados de estrógenos y debe comprobarse.

Por qué es importante la medición de estrógenos

La medición de estrógenos es un pilar de la endocrinología moderna. Desempeña un papel fundamental en la evaluación clínica de muchos trastornos endocrinos (relacionados con las hormonas), así como en la investigación que estudia cómo las hormonas influyen en la biología humana y en las enfermedades. Durante casi 30 años, los científicos y los médicos dependieron de los radioinmunoensayos (RIA) convencionales o de los enzimoinmunoensayos directos para medir los niveles de estrógenos circulantes.

Estos métodos más antiguos ofrecían una buena sensibilidad, pero presentaban un serio inconveniente: la falta de especificidad. Los anticuerpos utilizados en los inmunoensayos a menudo presentan reactividad cruzada con otros esteroides —moléculas químicamente similares a los estrógenos—, lo que da lugar a lecturas inexactas. Esta reactividad cruzada ha causado problemas importantes a la hora de interpretar los datos de los estudios epidemiológicos, y los resultados han variado con frecuencia de un laboratorio a otro.

Otra limitación importante de los métodos basados en inmunoensayos es que solo pueden medir un analito a la vez. Para medir todos los metabolitos (productos de degradación) de un solo estrógeno, los investigadores tienen que realizar múltiples ensayos por separado, lo que requiere mucho tiempo y es ineficaz. Sin embargo, en la última década, los avances significativos en una técnica denominada método de dilución isotópica con isótopos estables (SID) acoplada a cromatografía líquida–espectrometría de masas en modo de monitorización de reacciones seleccionadas (LC-SRM/MS) han ofrecido una solución potente a estos problemas.

Sin embargo, incluso con esta tecnología avanzada, sigue habiendo un reto formidable: cuantificar los estrógenos y sus metabolitos en muestras de suero y plasma de poblaciones con niveles de estrógenos extremadamente bajos. Esto incluye a hombres mayores, niños, mujeres posmenopáusicas y mujeres que reciben inhibidores de la aromatasa para el tratamiento del cáncer de mama. Esta revisión, elaborada por investigadores de la Facultad de Medicina Perelman de la Universidad de Pensilvania y del Instituto de Medicina Radiológica de Pekín, examina las cuestiones especiales que implica la utilización de la metodología SID LC-SRM/MS de sensibilidad ultraalta para estas muestras difíciles, y sugiere las mejores prácticas en cada paso del proceso analítico.

Cómo se procesan los estrógenos en el organismo

Comprender cómo se comportan los estrógenos en el organismo ayuda a explicar por qué su medición es tan importante. Múltiples estudios clínicos y experimentales han demostrado que los niveles relativamente altos de estrógenos en la sangre de las mujeres se asocian con un mayor riesgo de cáncer de mama, cáncer de endometrio y cáncer de ovario, aunque, en particular, muchos de estos estudios utilizaron ensayos RIA de validez cuestionable. En los hombres, el aumento de los estrógenos circulantes también es un factor de riesgo potencial para el cáncer de próstata.

La capacidad de medir con precisión el estradiol (E2) y la testosterona (T) en niños ha demostrado ser fundamental para diagnosticar y tratar los trastornos de la pubertad y del desarrollo sexual. Algunos estudios también han demostrado que los niveles más altos de estrógenos a edades más tempranas se correlacionan con el inicio del desarrollo mamario en las niñas, lo que sugiere que las hormonas durante el desarrollo podrían modular el riesgo de enfermedad más adelante en la vida.

Los estrógenos actúan a través de dos vías principales: mecanismos dependientes del receptor de estrógenos (ER) y mecanismos independientes del ER. La vía dependiente del ER implica la estimulación directa de la proliferación celular anormal, que está relacionada causalmente con el desarrollo del cáncer de mama. Se cree que los efectos carcinogénicos (causantes de cáncer) independientes del ER se producen a través de las acciones de metabolitos de estrógenos genotóxicos, es decir, que dañan el ADN.

Así es como funciona ese proceso:

1. Los estrógenos precursores experimentan un metabolismo oxidativo (modificación química por enzimas) a través de las enzimas citocromo P450 (CYP) 1B1 y CYP3A4.
2. Este proceso forma dos tipos de metabolitos de estrógenos catecol (una estructura química con dos grupos hidroxilo adyacentes): 2,3-catecoles (2-OH-E1 y 2-OH-E2) y 3,4-catecoles (4-OH-E1 y 4-OH-E2).
3. El CYP1B1 muestra una regioselectividad considerable —una preferencia de 9:1— por la formación de 4-OH-E1 y 4-OH-E2 en comparación con las formas 2-hidroxiladas.
4. Las investigaciones sugieren que el 4-OH-E1 y el 4-OH-E2 son más genotóxicos (dañinos para el ADN) que los metabolitos correspondientes 2-OH-E1 y 2-OH-E2.

Curiosamente, no todos los metabolitos de los estrógenos son perjudiciales. El 2-OH-E2 es un potente inhibidor de la aromatasa (una enzima que convierte los andrógenos en estrógenos), y el 2-OH-E1 se asocia con un riesgo reducido de cáncer de mama con receptor de estrógenos positivo (ER+) en mujeres posmenopáusicas, tras ajustar por las concentraciones de estrona (E1) circulante. Ambos catecoles son convertidos rápidamente por una enzima llamada catecol-O-metiltransferasa (COMT) en metabolitos metoxi (OMe). En particular, el 2-OMe-E2 tiene una actividad antiproliferativa significativa, lo que significa que ayuda a evitar que las células se multipliquen de forma descontrolada.

Los estrógenos y sus metabolitos hidroxilados también se modifican fácilmente mediante la adición de grupos glucurónido, sulfato o glutatión (GSH), formando metabolitos de estrógenos conjugados. Los conjugados de estrógenos circulantes más abundantes son los sulfatos, que pueden servir como precursores de estrógenos en el tejido mamario a través de la acción de las sulfatasas esteroideas. Los andrógenos circulantes también pueden servir como precursores de estrógenos en mujeres posmenopáusicas a través de la acción de la aromatasa, lo que proporciona una fuente de estrógenos fundamentalmente diferente en comparación con las mujeres premenopáusicas.

Debido a estos variados efectos y vías metabólicas, los estrógenos y sus metabolitos en el torrente sanguíneo son biomarcadores valiosos —indicadores biológicos— de la biosíntesis y el metabolismo de los estrógenos en los tejidos.

El desafío especial: poblaciones con estrógenos muy bajos

Para la mayoría de los adultos en sus años reproductivos, los niveles de estrógenos son lo suficientemente altos como para medirse con técnicas estándar. Pero ciertos grupos presentan un desafío analítico formidable porque sus niveles de estrógenos son extraordinariamente bajos.

Las concentraciones séricas típicas de E2 no conjugado en mujeres posmenopáusicas y hombres mayores suelen ser inferiores a 5 pg/mL (picogramos por mililitro: un picogramo es una billonésima parte de un gramo). A modo de comparación, los niveles de E1 no conjugado en estos grupos oscilan entre 11.8 y 37.4 pg/mL. Se ha informado que los niveles de E2 en estudios clínicos de endocrinología pediátrica son aproximadamente 100 veces más bajos que los de los adultos, y los niveles más bajos se presentan en las etapas prepuberales (antes de la pubertad).

Estos niveles bajos de pg/mL son extremadamente desafiantes para la mayoría de los ensayos basados en LC-MS. Para empeorar las cosas, otros metabolitos de estrógenos no conjugados, como los metoxiestrógenos (MeO-estrógenos) o los catecoles, están presentes en concentraciones aún más bajas, generalmente por debajo del límite inferior de cuantificación (LLOQ, la cantidad más pequeña que se puede medir de manera confiable) de la mayoría de los ensayos estándar de LC-MS.

El desafío de la sensibilidad se debe principalmente a las deficientes eficiencias de ionización de los estrógenos no conjugados y sus metabolitos, lo que significa que no adquieren fácilmente la carga eléctrica necesaria para que la espectrometría de masas los detecte. Por eso los científicos han desarrollado numerosas estrategias de derivatización (modificaciones químicas) para mejorar la ionización y aumentar la sensibilidad. Estas estrategias también suelen ayudar con la limpieza de la muestra.

En realidad, es más fácil medir los estrógenos totales (formas no conjugadas más conjugadas) después de una hidrólisis o solvólisis (descomposición química con agua o alcohol), porque los niveles de estrógenos totales son al menos 2 a 3 veces más altos que los niveles de estrógenos no conjugados. Sin embargo, evaluar la eficiencia y la uniformidad de la hidrólisis entre muestras sigue siendo problemático y puede producir resultados erróneos, porque no siempre se dispone de estándares auténticos y estándares de isótopos estables para todos los conjugados de estrógenos.

El método de referencia: cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas

El método de dilución isotópica con isótopos estables (SID) combinado con cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en modo de monitorización de reacciones seleccionadas (LC-SRM/MS) es ahora ampliamente aceptado como el «estándar de oro» para cuantificar estrógenos y sus metabolitos en suero y plasma. En comparación con los inmunoensayos, este enfoque ofrece una especificidad mejorada, alta exactitud y la capacidad de monitorizar múltiples estrógenos simultáneamente.

El principio funciona así: los investigadores añaden una cantidad conocida de una versión «pesada» (marcada con isótopos) de cada estrógeno a la muestra del paciente. Debido a que las versiones marcadas y no marcadas se comportan de manera idéntica durante la extracción y el análisis, los investigadores pueden calcular la cantidad exacta de estrógeno natural presente comparando las dos señales. Este enfoque autocorrector elimina muchos de los errores que afectan a los métodos más antiguos.

Se puede lograr una sensibilidad ultraalta cuando las moléculas de estrógeno se convierten en derivados «preionizados» (formas modificadas químicamente que ya portan una carga) y se analizan con espectrómetros de masas de triple cuadrupolo en modo de monitorización de reacciones seleccionadas (SRM), acoplados a cromatografía líquida de nanoflujo (una técnica que utiliza caudales extremadamente pequeños).

Dos métodos de referencia demuestran el poder de este enfoque:

• 2011: método del derivado de Girard P (GP): se utilizó para analizar E1 y sus metabolitos. Permitió a los investigadores usar solo 0.5 mL de suero. El LLOQ para cada estrógeno fue de 0.156 pg/mL (15.6 femtogramos [fg] en columna): un femtogramo es una milbillonésima parte de un gramo.
• 2015: método del derivado de N-metil piridinio-3-sulfonilo (NMPS): se utilizó para E2 y sus metabolitos. Requirió solo 0.1 mL de suero —una sola gota— y aun así logró una asombrosa sensibilidad de 1.0 fg en columna para cinco estrógenos y sus metabolitos.

Preparación de la muestra: preparándose para el análisis

Antes de que se pueda realizar cualquier medición de estrógenos, la muestra debe prepararse. Esto generalmente implica extracción (separar los estrógenos de otros componentes de la sangre), limpieza y concentración. Existen dos enfoques principales para manejar los estrógenos conjugados: se pueden descomponer en formas no conjugadas mediante hidrólisis antes del análisis, o se pueden medir como conjugados intactos.

La hidrólisis convierte los conjugados en formas no conjugadas, lo que aumenta su concentración en la muestra. Después de la hidrólisis, la extracción líquido-líquido (LLE) o la extracción en fase sólida (SPE) pueden extraer eficientemente los estrógenos del suero y el plasma.

Extracción líquido-líquido (LLE): la LLE es económica, rápida y a menudo el método de extracción principal para el análisis de estrógenos. Sus desventajas incluyen ser laboriosa, consumir mucho tiempo y ser más difícil de automatizar que la SPE. Los disolventes más utilizados son el metil terc-butil éter (MTBE), el éter dietílico, el diclorometano o mezclas de disolventes orgánicos. El MTBE puede extraer tanto estrógenos no conjugados del suero como derivados de estrógenos del tampón de derivatización.

Una investigación exhaustiva de Keski-Rahkonen y colaboradores comparó la eficiencia de extracción de MTBE, éter dietílico, hexano y 2-metilbutano a partir de muestras de suero. El estudio mostró que la LLE con MTBE recuperó por completo las hormonas esteroideas analizadas, a diferencia de los otros disolventes, lo que la convierte en la opción preferida.

Extracción en fase sólida (SPE): la SPE fuera de línea o en línea acoplada a LC-MS es una técnica muy prometedora para el análisis de muestras semiautomatizado. Las ventajas de la SPE en línea incluyen un tiempo de análisis más corto, bandas cromatográficas más concentradas y un riesgo de contaminación muy reducido.

Un estudio notable de Zhao y colaboradores informó un método de LC-MS para determinar 12 estrógenos no conjugados y sus conjugados intactos en sangre y orina. Este método utilizó solo un paso de SPE tanto para los estrógenos no conjugados como para sus conjugados: después de cargar las muestras en un cartucho Oasis HLB (equilibrio hidrofílico-lipofílico), los estrógenos no conjugados se eluyeron primero con acetato de etilo, y los conjugados se eluyeron después con metanol que contenía hidróxido de amonio al 0.1%.

Un estudio más reciente describió un proceso automatizado de atrapamiento y elución en línea que utiliza una columna de atrapamiento de material de acceso restringido (RAM) de intercambio catiónico débil (WCX) con dilución en línea. Este enfoque muestra potencial para su uso con muestras de hombres mayores, niños y mujeres posmenopáusicas porque el procedimiento simplificado requiere solo 100 μL de suero, alcanza un LLOQ de 3 pg/mL y proporciona una exactitud y precisión excelentes.

Dos enfoques para los estrógenos conjugados:

El primer enfoque implica la hidrólisis de los conjugados de β-glucurónido y sulfato antes de la extracción y la derivatización. La enzima más utilizada es la β-glucuronidasa/arilsulfatasa purificada del caracol Helix pomatia. Esta enzima contiene de forma natural actividades de β-glucuronidasa y sulfatasa en cantidades casi iguales. En cambio, la enzima de E. coli contiene solo β-glucuronidasa y está prácticamente libre de actividad de sulfatasa.

Sin embargo, los investigadores deben ser cautelosos: la evidencia muestra que el extracto de Helix pomatia está contaminado con actividad de 3β-hidroxiesteroide deshidrogenasa (HSD) o de colesterol oxidasa. Esto podría confundir los estudios en los que los analitos de interés son sustratos de la 3β-HSD, una cuestión muy importante si se analizan andrógenos en la misma muestra.

Los experimentos con conjugados de sulfato de estrógeno sintetizados revelaron otra limitación crítica: solo la forma 3-sulfato se escinde mediante hidrólisis enzimática; el grupo 17-sulfato es resistente. Una alternativa prometedora implica la solvólisis de los conjugados utilizando cloruro de hidrógeno metanólico anhidro, un enfoque publicado por primera vez por Tang y Crone en 1989 y utilizado posteriormente por varios grupos de investigación. Sorprendentemente, este método no parece haberse aplicado a muestras de suero y plasma de hombres mayores, niños y mujeres posmenopáusicas.

El segundo enfoque implica analizar el conjugado intacto mediante espectrometría de masas en modo de iones negativos, sin hidrólisis enzimática ni derivatización. Estudios recientes observaron que la concentración total de E1 en mujeres posmenopáusicas oscila entre 61.3 y 442.1 pg/mL, incluido el sulfato de E1 a una concentración media de 244.8 pg/mL. Estos niveles más altos de glucurónido de E1 o sulfato de E1 podrían cuantificarse con relativa facilidad mediante LC-MS. El sulfato de E1 en suero puede extraerse de manera eficiente utilizando cartuchos Oasis HLB o de intercambio aniónico débil (WAX) y eluirse con acetato de amonio o hidróxido de amonio.

Este enfoque de conjugado intacto es prometedor, pero se enfrenta a un obstáculo importante: la falta de estándares auténticos de conjugados de estrógenos y de análogos de isótopos estables pesados para su uso como estándares internos. Por ejemplo, solo uno de los cinco posibles sulfatos de E2 (3-sulfato, 17-sulfato, 3-sulfato 17-glucurónido, 3-glucurónido 17-sulfato y 3,17-bis-sulfato) está disponible comercialmente en la actualidad: el 17β-E2-2,4,6-[²H]₄-3-sulfato.

Derivatización: aumentar la sensibilidad mediante la química

Dado que los estrógenos no conjugados existen en concentraciones extremadamente bajas en la sangre de hombres mayores, niños y mujeres posmenopáusicas, la medición fiable requiere actualmente una derivatización, es decir, unir un grupo químico a la molécula de estrógeno para mejorar su capacidad de detección. Se han desarrollado muchos reactivos de derivatización química para este fin, dirigidos al grupo hidroxilo fenólico (un grupo -OH reactivo unido al anillo aromático) de las moléculas de estrógeno.

Los reactivos de derivatización descritos incluyen:

• Pentafluorobencilo (PFB)
• Piridil-3-sulfonilo (PS)
• Dansilo (D)
• 2-Picolinoílo (P)
• N-metil-2-piridinilo (NMP)
• N-metil-nicotinoílo (NMN)
• 1-(2,4-dinitro-5-fluorofenil)-4,4-dimetilpiperazinilo (MPPZ)
• 3-pentafluorobencil-17β-piridinio (PFBPY)
• cloruro de 1,2-dimetilimidazol-5-sulfonilo (DMIS)

La mayoría de estos derivados (PFB, PNB, PS, D y P) no llevan una carga eléctrica en la molécula, lo que limita su capacidad para alcanzar límites de detección bajos de pg/mL. Además, dado que los estrógenos son químicamente similares entre sí, estos derivados tienden a producir patrones de fragmentación no específicos, lo que provoca una especificidad analítica deficiente.

Los derivados que portan una carga permanente — MP, NMN, MPPZ, PFBPY y DMIS — son mucho más adecuados para alcanzar una sensibilidad de pg/mL. Pero el enfoque más potente hasta la fecha provino del propio laboratorio de los autores: el derivado NMPS (N-metil piridinio-3-sulfonilo). Este procedimiento de derivatización preionizada convierte el E2 y sus metabolitos en moléculas con carga permanente. Con un LLOQ de 1,0 fg en columna con un volumen de inyección de 1 μL, permite la cuantificación absoluta de estrógenos no conjugados en muestras de suero de mujeres posmenopáusicas y hombres mayores. Dado que la derivatización ocurre en el grupo hidroxilo fenólico — una característica compartida por todos los estrógenos — este método puede generalizarse para medir todos los estrógenos.

Con cualquier análisis de alta sensibilidad, los investigadores deben actuar con extrema precaución. Cantidades mínimas de contaminación, arrastre de una inyección previa o interferencia de fondo de los suministros de procesamiento pueden comprometer la calidad de los datos. Es especialmente importante utilizar una matriz en blanco apropiada (una muestra sin estrógenos) para verificar el fondo del sistema proveniente de los tubos, los solventes de extracción, los tampones de derivatización y el propio instrumento.

Esta no es una preocupación teórica. Durante su propio trabajo, los autores descubrieron inesperadamente que algunos tubos de vidrio causaban interferencia en la señal de E2 equivalente a aproximadamente 10 pg/mL en suero durante la hidrólisis enzimática — una cantidad lo suficientemente grande como para invalidar por completo los resultados en una población donde los niveles normales de E2 están por debajo de 5 pg/mL.

Separación cromatográfica: distinguir moléculas similares

En la cuantificación de estrógenos basada en LC-SRM/MS, la interferencia que surge de compuestos isobáricos — moléculas con la misma masa que no son el estrógeno objetivo — puede ser un problema crítico. Estas interferencias isobáricas pueden provenir de fuentes exógenas (fuera del cuerpo) o de compuestos endógenos (presentes naturalmente en el cuerpo), incluidos otros esteroides.

Desafortunadamente, los estrógenos y sus metabolitos tienden a formar iones producto similares cuando se fragmentan en espectrometría de masas en tándem (MS/MS). Por ejemplo, cuando se analizan derivados de dansilo, el ion producto m/z 171 (una relación masa-carga específica) se selecciona comúnmente como cuantificador o calificador para todos los estrógenos y sus metabolitos, ya que se origina del propio grupo dansilo. Esta universalidad se convierte en un problema: si E1 y sus metabolitos no se separan cromatográficamente de E2 y sus metabolitos, puede ocurrir una sobreestimación del E2 no conjugado — particularmente dado que el E1 no conjugado suele ser 2–3 veces mayor que el E2 en concentración.

Aún más desafiante es cuantificar con precisión los isómeros individuales de los catecolestrógenos — específicamente 2- y 4-OH-E1, 2- y 4-OH-E2, y sus correspondientes metoxi-metabolitos — porque estos isómeros son extremadamente similares en estructura y deben separarse entre sí cromatográficamente.

Los investigadores han desarrollado varias estrategias para abordar esto:

• Aumentar la capacidad de pico (la capacidad de separar muchos compuestos en una sola corrida)
• Optimizar la elución en gradiente (cambiar gradualmente la composición del solvente con el tiempo)
• Usar partículas de fase estacionaria más pequeñas — cada vez más, se utilizan partículas sub-2 μm para mejorar la capacidad cromatográfica, la sensibilidad y la velocidad del análisis.

Como ejemplo, en un estudio reciente de los autores, 12 metabolitos de estrógenos se separaron exitosamente en una columna Waters BEH130 C18 (150 μm × 100 mm, 1,7 μm, 130 Å) en 45 minutos después de la derivatización con sulfonilo de piridinio. Esto incluyó cuatro catecolestrógenos (4-OHE1, 2-OHE1, 4-OHE2, 2-OHE2) y cuatro MeO-estrógenos (4-MeOE1, 2-MeOE1, 4-MeOE2, 2-MeOE2).

Efectos de matriz: el problema oculto de la interferencia

El suero y el plasma humanos son mezclas biológicas complejas. Contienen componentes como fosfolípidos y sales que pueden mejorar o suprimir la eficiencia de ionización de los estrógenos — es decir, pueden hacer que la señal de estrógenos sea más fuerte o más débil de lo que debería ser. Estos "efectos de matriz" han sido llamados el potencial "talón de Aquiles" del análisis de muestras biológicas basado en LC-MS/MS.

En un hallazgo particularmente problemático, Keski-Rahkonen y colegas encontraron efectos de matriz cuando los ensayos basados en LC-MS se realizaron en tubos de ensayo o placas de pocillos hechos de plástico — un material de laboratorio común que podría introducir variabilidad inesperada.

Un peligro sutil: los compuestos coeluyentes (sustancias que salen de la columna cromatográfica al mismo tiempo que el estrógeno objetivo) pueden no ser siempre visibles en los rangos o transiciones monitoreados. Este fenómeno se conoce como "picos fantasma" — interferencias invisibles que pueden corromper silenciosamente los resultados.

Para el análisis de estrógenos, la ionización por electrospray en modo positivo (ESI) es el método de ionización más utilizado después de la derivatización. Sin embargo, se ha argumentado que ESI es más susceptible a la supresión iónica que la ionización química a presión atmosférica (APCI). Curiosamente, la investigación mostró que el E2 no derivatizado tuvo un aumento de sensibilidad de al menos 10 veces en modo negativo de ESI en comparación con la fotoionización a presión atmosférica (APPI) en modo positivo, y no sufrió interferencia por compuestos isobáricos coeluyentes.

Existen tres estrategias generales para evaluar los efectos de matriz:

1. Infusión post-columna: Infundir continuamente el analito en el espectrómetro de masas mientras se inyecta una muestra de matriz en blanco para observar los cambios en la señal.
2. Adición post-extracción: Agregar una cantidad conocida de analito a la matriz en blanco extraída y compararla con una solución pura.
3. Comparación de las pendientes de las curvas de calibración: Comparación de la pendiente de una curva de calibración preparada en matriz con una preparada en solución pura.

Según la guía de la FDA de 2013, se deben tomar las medidas adecuadas para garantizar la ausencia de efectos de matriz durante toda la aplicación del método, especialmente si la matriz utilizada para los lotes de producción difiere de la matriz utilizada durante la validación del método. Los criterios de aceptación exigen que el valor medido esté dentro del rango de sesgo del 15% del valor nominal, mientras que el coeficiente de variación (CV, una medida de la dispersión de los resultados) debe ser inferior al 15%.

Varios enfoques pueden reducir los efectos de matriz en la cuantificación de estrógenos:

• Mejorar el procedimiento de preparación de la muestra
• Optimizar la separación cromatográfica
• Emplear estándares internos marcados con isótopos estables

Pero incluso los estándares internos requieren una consideración cuidadosa. Los investigadores deben tener precaución al utilizar estándares internos análogos con [²H] (marcados con deuterio), porque un cambio en el tiempo de retención entre los compuestos no marcados y los marcados con deuterio puede ser analíticamente significativo, lo que lleva a una supresión diferencial de las señales del analito y del estándar interno. Idealmente, se deben utilizar análogos que contengan [¹³C] (marcados con carbono-13) de los analitos objetivo como estándares internos porque coeluyen exactamente en todas las condiciones cromatográficas. También eliminan la posibilidad de intercambio de deuterio en disolventes próticos (que contienen agua). Con la resolución cromatográfica mejorada proporcionada por partículas sub-2 μm, podría ocurrir una mayor separación entre los analitos y sus correspondientes análogos de deuterio, reduciendo aún más la eficacia del estándar interno.

Implicaciones clínicas: qué significa esto para los pacientes

Estos avances técnicos no son solo ejercicios académicos: tienen implicaciones directas para la atención del paciente. Para las mujeres posmenopáusicas que toman inhibidores de la aromatasa para tratar el cáncer de mama, conocer sus niveles reales de estrógenos ayuda a los oncólogos a determinar si el fármaco está funcionando eficazmente. Para los niños sometidos a evaluación por pubertad precoz o retrasada, las mediciones precisas de estrógenos guían las decisiones de tratamiento que pueden afectar el crecimiento y el desarrollo.

Para los hombres mayores, los niveles de estrógenos se reconocen cada vez más como relevantes para el riesgo de cáncer de próstata y la salud ósea. Y para las mujeres posmenopáusicas, la evaluación precisa de la exposición a estrógenos es fundamental para evaluar el riesgo de cáncer de mama y para seleccionar estrategias preventivas adecuadas.

Los métodos ultrasensibles descritos en esta revisión, en particular el enfoque de derivatización NMPS que requiere solo 0.1 mL de suero, permiten una medición precisa a niveles que antes eran indetectables. Esto abre la puerta a un mejor seguimiento clínico y a una investigación más fiable sobre cómo las hormonas afectan el riesgo de enfermedad a lo largo de la vida. La capacidad de medir 12 metabolitos de estrógenos diferentes en una sola corrida de 45 minutos, a partir de una sola gota de sangre, representa una mejora drástica con respecto a los días en que cada estrógeno requería un inmunoensayo separado con una precisión cuestionable.

Limitaciones del enfoque actual

A pesar de estos avances, siguen existiendo limitaciones importantes. En primer lugar, la evaluación de los efectos de matriz es más complicada para el análisis de estrógenos porque no se dispone fácilmente de una matriz en blanco adecuada, es decir, una muestra que se sepa que está completamente libre de estrógenos. El enfoque general es preparar estándares de calibración y muestras de control de calidad en matrices sustitutas, como suero tratado con carbón activado. Sin embargo, el proceso de tratamiento con carbón activado puede eliminar componentes de las muestras reales que causan efectos de matriz, lo que significa que los estándares de calibración podrían no representar completamente las muestras reales de pacientes.

En segundo lugar, los estándares internos marcados con isótopos, a pesar de su nombre, pueden no corregir siempre perfectamente todas las fuentes de variación, en particular si los compuestos marcados con deuterio cambian el tiempo de retención y experimentan una supresión de ionización diferente a la de los estrógenos naturales.

En tercer lugar, la evaluación de la eficiencia de la hidrólisis en todas las muestras sigue siendo difícil debido a la falta de estándares auténticos y estándares de isótopos estables para todas las formas conjugadas. La frustración de medir los conjugados intactos se ve agravada por la disponibilidad comercial muy limitada de los estándares de referencia necesarios: actualmente solo está disponible para su compra una de las cinco formas de sulfato de E2.

Finalmente, las preparaciones enzimáticas utilizadas para la hidrólisis pueden introducir factores de confusión. La enzima de Helix pomatia comúnmente utilizada está contaminada con actividad de 3β-HSD, lo que podría interferir si se miden andrógenos en la misma muestra. Y algunos metabolitos de estrógenos no conjugados en circulación tienen concentraciones por debajo del LLOQ incluso de estos métodos avanzados.

Recomendaciones para investigadores y clínicos

Basándose en su amplia experiencia, los autores ofrecen las siguientes recomendaciones prácticas para cualquier persona que realice análisis de estrógenos de sensibilidad ultraalta:

1. Preanalizar todos los suministros: Los tubos, reactivos y enzimas deben preanalizarse para garantizar que no introduzcan contaminación ni interferencias. El propio descubrimiento de los autores de que los tubos de vidrio podían contribuir con una señal similar a la de los estrógenos equivalente a 10 pg/mL es una advertencia.
2. Utilizar MTBE para la extracción líquido-líquido: Demostró la recuperación más completa de las hormonas esteroideas analizadas en comparación con el éter dietílico, el hexano y el 2-metilbutano.
3. Elija reactivos de derivatización preionizados: los derivados NMPS proporcionan cargas permanentes que logran la mayor sensibilidad (1,0 fg en columna) al derivatizar en el grupo hidroxilo fenólico, lo que hace que el método sea aplicable a todos los estrógenos.
4. Optimice la separación cromatográfica con columnas de partículas sub-2 μm: estas proporcionan la resolución necesaria para separar catecoles isoméricos y metoxiestrógenos que de otro modo causarían errores de sobreestimación.
5. Prefiera estándares internos marcados con ¹³C: coeluyen exactamente con los analitos objetivo en todas las condiciones cromatográficas, eliminando los problemas de desplazamiento del tiempo de retención asociados con los marcajes de deuterio.
6. Considere analizar los conjugados intactos: esto evita por completo los problemas de hidrólisis, aunque actualmente está limitado por la disponibilidad de estándares de conjugados.
7. Realice una validación exhaustiva del método: confirme la sensibilidad, especificidad y reproducibilidad del ensayo antes de analizar muestras clínicas, siguiendo las directrices de la FDA con criterios de aceptación de ±15 % de sesgo y un CV inferior al 15 %.
8. Tenga en cuenta las limitaciones de la matriz sustituta: el suero tratado con carbón activado puede no imitar completamente las muestras reales de pacientes, por lo que los resultados deben interpretarse con la debida precaución.

Estas recomendaciones son especialmente relevantes para los laboratorios clínicos y los grupos de investigación que trabajan con muestras de hombres mayores, niños, mujeres posmenopáusicas y mujeres que toman inhibidores de la aromatasa, poblaciones en las que la medición precisa y ultrasensible de estrógenos puede influir directamente en el diagnóstico, las decisiones de tratamiento y los resultados de los pacientes.

Preguntas frecuentes

¿Por qué es tan difícil medir el estrógeno en personas con niveles muy bajos?

En grupos como las mujeres posmenopáusicas, los hombres mayores y los niños, los niveles de estrógeno pueden estar por debajo de 5 picogramos por mililitro, a menudo 100 veces más bajos que en los adultos. Cantidades tan pequeñas son difíciles de detectar porque las moléculas de estrógeno no se ionizan eficientemente en los instrumentos de laboratorio estándar. Los químicos utilizan modificaciones químicas especiales y espectrometría de masas extremadamente sensible para medirlas con precisión.

¿Cuáles eran los principales problemas de las pruebas de estrógeno más antiguas (inmunoensayos)?

Las pruebas más antiguas que utilizaban anticuerpos a menudo presentaban reactividad cruzada con moléculas similares, dando lecturas inexactas. Los resultados variaban entre laboratorios y cada prueba solo podía medir un estrógeno a la vez. La medición de múltiples productos de degradación de estrógenos requería muchas pruebas separadas, lo que hacía que el proceso fuera lento y poco fiable para niveles bajos.

¿Qué tan precisos son los métodos modernos de espectrometría de masas para las pruebas de estrógeno?

Las técnicas modernas que utilizan dilución isotópica con isótopos estables y cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas se consideran ampliamente el estándar de oro. Ofrecen una mejor especificidad, alta precisión y pueden medir múltiples estrógenos a la vez. Al añadir una cantidad conocida de estrógeno marcado, los científicos comparan las señales para calcular los niveles naturales exactos, corrigiendo muchos errores de los métodos más antiguos.

¿Qué significa una prueba de estrógeno ultrasensible para una mujer que toma inhibidores de la aromatasa?

Para las mujeres posmenopáusicas con cáncer de mama que toman inhibidores de la aromatasa, conocer con precisión los niveles reales de estrógeno ayuda a los oncólogos a ver si el fármaco está funcionando. Las pruebas más antiguas pueden haber pasado por alto niveles muy bajos. Las pruebas ultrasensibles pueden medir el estrógeno a partir de una sola gota de sangre, ofreciendo un seguimiento más fiable de la eficacia del tratamiento.

¿Por qué es importante la medición precisa de estrógenos para los niños con problemas de pubertad?

En los niños que están siendo evaluados por pubertad precoz o retrasada, los niveles de estrógeno guían las decisiones de tratamiento que pueden afectar el crecimiento y el desarrollo. Los niveles de estrógeno en los niños pueden ser unas 100 veces más bajos que los niveles en adultos, lo que dificulta su medición. Los métodos avanzados ahora permiten una medición precisa a partir de muestras de sangre muy pequeñas, ayudando a los médicos a proporcionar una atención adecuada.

¿Cuánta sangre se necesita para una prueba de estrógeno ultrasensible?

Algunos métodos avanzados requieren tan solo 0,1 mililitros de suero, aproximadamente una sola gota de sangre. Por ejemplo, un método que utiliza derivatización con N-metil piridinio-3-sulfonilo logró una alta sensibilidad con solo 0,1 mL. Un método anterior necesitaba 0,5 mL. Los requisitos de muestra más pequeños facilitan las pruebas para niños y pacientes frágiles.

¿Cuáles son los beneficios de las pruebas de estrógenos más nuevas en comparación con las pruebas más antiguas?

Las pruebas más nuevas pueden medir hasta 12 metabolitos de estrógenos diferentes en una sola prueba de 45 minutos a partir de una sola gota de sangre. Proporcionan una precisión mucho mayor en niveles muy bajos, evitan los problemas de reactividad cruzada y ofrecen resultados fiables para guiar el tratamiento de afecciones como el cáncer de mama, los trastornos de la pubertad y el riesgo de cáncer de próstata. Esto mejora el seguimiento clínico y la investigación.

¿Debería obtener una segunda opinión sobre los resultados de mi prueba de estrógenos si soy una mujer posmenopáusica o un hombre mayor con niveles de estrógenos muy bajos?

Sí, una segunda opinión puede ser valiosa porque las pruebas de inmunoensayo más antiguas a menudo daban lecturas inexactas debido a la reactividad cruzada, y los resultados variaban entre laboratorios. Los métodos modernos de espectrometría de masas son el estándar de referencia y pueden medir con precisión niveles muy bajos de estrógenos, por debajo de 5 pg/mL, utilizando una sola gota de sangre. Si su prueba se realizó con un método más antiguo, una segunda opinión que utilice técnicas avanzadas puede proporcionar resultados más fiables, lo cual es importante para el seguimiento de la terapia con inhibidores de la aromatasa o para evaluar el riesgo de cáncer. Diagnostic Detectives Network proporciona segundas opiniones expertas independientes.

Información de la fuente

Este artículo para pacientes se basa en investigaciones revisadas por pares del Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology.

Original article title: Ultra-high sensitivity analysis of estrogens for special populations in serum and plasma by liquid chromatography-mass spectrometry

Authors: Qingqing Wang, Clementina Mesaros, and Ian A. Blair

Publication details: J Steroid Biochem Mol Biol. 2016 September; 162: 70–79. doi:10.1016/j.jsbmb.2016.01.002 (Published in final edited form as an HHS Public Access author manuscript, available in PMC 2017 September 01)

Affiliations: Center of Excellence in Environmental Toxicology and Penn SRP Center, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA; Department of Systems Pharmacology and Translational Therapeutics, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania; Department of Pharmacology and Toxicology, Beijing Institute of Radiation Medicine, Beijing, China.

Nota: Este artículo explica el contenido técnico de la revisión científica original en un lenguaje comprensible para los pacientes. Está destinado a fines educativos y no constituye asesoramiento médico. Los pacientes con preguntas sobre las pruebas de estrógenos o afecciones relacionadas con las hormonas deben consultar a su proveedor de atención médica.